高铁酸盐和亚硝酸盐在促进活性污泥溶解和产酸发酵中的协同作用：有效性评估和机理阐明

摘要：本研究证明了高铁酸钾（PF）和亚硝酸盐在促进WAS溶解和产酸发酵以收获挥发性脂肪酸（VFAs）方面的协同作用。结果表明，PF+NaNO2共预处理使峰值可溶性化学需氧量（SCOD）比单一亚硝酸盐预处理和PF预处理提高7.44倍和1.32倍，而与单一预处理（亚硝酸盐和PF）发酵相比，VFAs的产量分别提高了2.77倍和2.11倍（最大VFAs累积量为3536.25±115.24mg COD/L）。产酸发酵后，WAS的脱水能力得到改善。机理分析说明PF和亚硝酸盐的共预处理是通过增加关键水解酶活性、增强代谢功能基因表达、改变微生物生物转化途径和提高产酸发酵中关键微生物的丰度来增强VFA生成的。机理研究表明，添加PF有助于形成相对导电的发酵环境，以提高电子转移（ET）效率，这有助于VFAs的生物转化。该研究为提高WAS有机物的生物降解/生物转化效率提供了一种有效的策略。

引言：近年来，高铁酸钾（PF）因其强氧化性和绿色无害性而受到广泛关注。之前的研究表明，在添加K2FeO4后，PF能够分解WAS胞外聚合物质（EPS），并促进颗粒有机物的溶解，促进污泥的溶解。然而，PF在酸性条件下的不稳定性和高成本抑制了其进一步应用。因此，需要一些辅助措施来通过产酸发酵进一步提高WAS的生物固体转化效率。

亚硝酸盐被证明能够有效破解污泥固体中的微生物细胞壁，以提高水解效率，进而增强WAS的厌氧发酵。此外，亚硝酸盐的添加可以促进微生物细胞裂解/死亡，导致SCOD增加。与FNA相比，亚硝酸盐在破坏污泥细胞方面发挥了更有效的作用。同时，亚硝酸盐预处理能够实现与FNA几乎相等的甲烷产量，但更节省成本。因此，亚硝酸盐可能更有助于PF增强WAS的溶解和产酸发酵。

基于上述，本研究的主要目的是揭示PF+亚硝酸盐对WAS溶解和产酸发酵产生VFAs的协同作用。一方面，充分阐明WAS的溶解性、脱水特性以及与水解相关的关键酶活性。另一方面，全面阐明PF+亚硝酸盐促进WAS产酸发酵和VFAs产生的机制。

 

Fig. 1. WAS solubilisation by various pretreatments/co-pretreatments. A. SCOD Changes. B. Soluble protein and C. EEM spectra after 48h- pretreatments/co-pretreatments. Blank was the fresh WAS supernatant. PF and N represented the PF- and NaNO2- pretreatment. The 1/1(PF/NaNO2), 1/2(PF/NaNO2), 2/1(PF/ NaNO2), 1/3(PF/NaNO2) and 3/1(PF/NaNO2) stood for co-pretreatment of PF+NaNO2 with adding mole ratio of 1/1, 1/2, 2/1, 1/3 and 3/1, respectively.

    PF+亚硝酸盐共预处理引发WAS固相中可溶性有机物的释放（如图1所示）。PF/亚硝酸盐=1/3的共预处理使SCOD在前16小时急剧增加，达到2680±110.8mg/L的最大增量，这是单亚硝酸盐和PF预处理的7.44倍和1.32倍（图A）。同时，在PF/亚硝酸盐=1/3共预处理25小时后，上清液中观察到可溶性蛋白浓度峰值为398.10±10.5 mg/L（图B）。这些结果表明，由于PF的强氧化破坏了WAS絮体的结构，PF+亚硝酸盐的共预处理能够有效促进污泥溶解，从而释放大量有机物。

    图C显示了48小时共预处理后WAS上清液中有机物的3D-EEM光谱对比分析。峰A代表不可生物降解的物质（如黄腐酸、腐植酸等），而峰B主要代表可溶性微生物代谢物（如蛋白质肽等）。共预处理后这两个峰的强度显著高于空白试验中的强度。共预处理（PF/亚硝酸盐=1/3）在峰B中显示出相对较高的荧光强度。结果推断，这种共预处理促进了污泥固相中可生物降解物质的释放。

 

Fig. 2. The WAS dewaterability and particle size changes by various pretreatments and acidogenic fermentation., A. CST changes after pretreatment/co-pretreatment (s) for 48 h, B. CST changes after a 12 D- anaerobic fermentation enhanced by different pretreatment/co-pretreatment(s). C. WAS particle size distribution after pretreatment/co-pretreatment(s) for 48 h, D. WAS particle size distribution after 12 D-anaerobic fermentation enhanced by different pretreatment/co-pretreatment(s). 

 

    图A描述了单预处理和共预处理WAS在48小时操作时间的CST测试结果。  单PF预处理WAS的CST显著高于空白试验，表明污泥的脱水性能恶化。PF的强氧化性对WAS絮体结构解体、EPS的松散和固体有机物溶解有积极贡献，这增加了WAS的粘度，并恶化了WAS脱水特性，这与之前的结果一致。同时，在产酸发酵过程中，一些WAS颗粒可以进一步减少为小分子，这大大降低了WAS的粘度，WAS的CST值降低（图B），表明产酸发酵对促进WAS的脱水和过滤性能具有积极影响。

    颗粒尺寸在影响污泥脱水能力方面发挥了重要作用。从图C中的粒度分布变化可以看出，在PF/亚硝酸盐=1/3的共预处理中，d50值从空白试验中的27.95μm降至25.97μm。共预处理显著降低了WAS絮体的粒径，这可能是由于污泥结构的破碎程度较高，并通过PF的强氧化促进WAS溶解所致。此外，在共预处理后，DSI值从0.774降至0.747（表2），这导致污泥脱水和沉淀的恶化。这可能是由于Fe3+（由PF氧化产生）聚集破碎的污泥颗粒发生絮凝作用并抑制污泥脱水和沉淀。

    从发酵后WAS的粒径分布(图D)可以看出，共预处理WAS产酸发酵后，污泥粒径变大，小颗粒减少。此外，发酵污泥的DSI增加(表2)，说明发酵后污泥的脱水和沉淀性能得到改善，对固液分离有积极贡献。

 

Fig. 3. NO2? changes and FTIR spectra characteristics. A. NO2? concentration changes; B. Changes of FTIR spectra of WAS before/after pretreatments; C. Changes of FTIR spectra of various pretreated WAS before/after acidogenic fermentation. 

    在共预处理期间，亚硝酸盐含量在最初的16小时内略有波动(图A)，这是SCOD和可溶性蛋白快速释放的时期。然而，随着时间的增加，亚硝酸盐通过反硝化细菌的反硝化作用被消耗。

    图B和C分别为共预处理和产酸发酵前后WAS样品的红外光谱对比。3435cm?1处的吸收峰和峰值强度同时降低，说明污泥固相中的大分子有机物(如碳水化合物和蛋白质)被分解，导致了SCOD和可溶性蛋白的增加。2930cm?1波长附近的峰值主要属于C-H的拉伸振动，代表脂肪族亚甲基。在红外光谱中，在1660和1027cm?1处的吸收峰分别对应于C= O和C-O-P的拉伸振动，它们代表了作为微生物细胞壁和细胞膜主要成分的各种小分子物质。这些峰的强度在共预处理后明显减弱，推测微生物细胞壁被破坏并流入液相。

 

Fig. 4. VFAs production in WAS anaerobic fermentation enhanced by various pretreatment/co-pretreatment (s). A. Total VFAs production and B. The optimal VFAs production compo-sition. Blank was the unpretreated WAS-fermentation. PF and NaNO2 represented the PF- and NaNO2 pretreatment-fermentation. The 1/1 (PF/NaNO2), 1/2(PF/NaNO2), 2/1(PF/NaNO2), 1/3(PF/NaNO2) and 3/1(PF/NaNO2) stood for the fermentations enhanced by co-pretreatment of PF+NaNO2 with adding mole ratio of 1/1, 1/2, 2/1, 1/3 and 3/1, respectively. 

    如图4所示，所有预处理/共预处理均能明显促进WAS产酸发酵VFAs的产生。单一PF和单一亚硝酸盐预处理使发酵4d后VFAs产量达到最高，分别达到1273.16±22 mg COD/L和1676.95±51 mg COD/L。在共预处理的WAS发酵中，在第6天VFAs峰值为3536.25±115 mg COD/L，分别是空白、单一PF和单一亚硝酸盐预处理发酵的4.28倍、2.77倍和2.11倍(图A)。这表明，PF+亚硝酸盐的共预处理促进了WAS生物固体厌氧产酸。

    乙酸、丙酸和异戊酸在所有预处理/共预处理污泥发酵中是主要累积的酸(图B)。在PF/亚硝酸盐=1/3的共预处理中，乙酸（50.64%）和丙酸（10.06%）是两种主要的VFA化合物，可以用作外部碳源，以提高N和P的去除效率。

 

Fig. 5. Hydrolase activity changes in WAS anaerobic fermentation assisted with various pretreatment/co-pretreatment(s). A. Protease; B. α-Glucosidase. 

    蛋白酶和α-葡萄糖苷酶对污泥发酵过程中的可溶性有机物分解起着至关重要的作用，其活性如图5所示。PF+亚硝酸盐的共预处理明显提高了水解酶的活性。通常，水解酶活性与污泥水解过程密切相关，直接决定酸化效率和VFAs产量。PF+亚硝酸盐的共预处理能够导致WAS产生大量可溶性有机物，以通过产酸微生物将大分子碳水化合物和蛋白质转化为VFA，这与先前的研究一致。

 

Fig. 6. Microbial community profiles in WAS anaerobic fermentation assisted with various pretreatment/co-pretreatment(s) (Blank, PF, N and 1/3 stood for the blank test, PF pretreatment-fermentation, nitrite pretreatment-fermentation and co-pretreatment of PF/NaNO2=1/3-fermentation). A. at phylum level and B. at genus level. 

    图6描述了在门水平上发酵微生物的相对丰度。优势菌门包括变形杆菌、氯菌灵菌、厚壁菌门和拟杆菌门，分别占总微生物丰度的78.57%、82.52%、80.12%和93.95%，在共预处理（PF/亚硝酸盐=1/3）中，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度明显增加，而变形杆菌门的丰度显著下降。厚壁菌能够水解复杂的大分子并将其转化为小分子，这有利于VFAs的生产。拟杆菌是一种用于VFAs生产的蛋白质水解细菌。变形杆菌主要被报道为一种消耗VFA的门。总的来说，共预处理（PF/亚硝酸盐=1/3）增加了WAS发酵系统中厚壁菌的水解细菌和拟杆菌的产酸细菌的丰度，同时降低了变形杆菌消耗VFAs的量，从而有效地促进了VFAs的积累。

    相比之下，在属水平上，共预处理的WAS发酵中微生物群落组成发生了很大变化（图B）。假单胞菌(Pseudomonas)和丹毒丝菌(Erysipelothrix)的丰度最高，分别为33.01%和15.39%。假单胞菌可在厌氧条件下通过磷酸转乙酰酶和乙酸激酶将丙酮酸转化为乙酸。丹毒丝菌是一种常见的产生VFAs的细菌。综合来看，发酵前6d，厌氧菌科和腐螺旋菌科水解菌的丰度下降，而假单胞菌和丹毒丝菌积累较多。

    因此，PF+亚硝酸盐共同预处理重塑了微生物群落多样性，优势属富集了Pseudomonas、Erysipelothrix、alkiflexus、Macellibacteroides、Proteiniclasticum、Alkaliphilus、Acinetobacter和Paenisporosarcina，它们的相互作用合作促进了VFAs的产生(如图7所示)。

 

Fig. 7. Schematic diagram of microbial mechanism for promoting VFAs production during WAS anaerobic fermentation assisted by the co-pretreatment of PF combined with nitrite. 

    图7给出了PF+亚硝酸盐共同预处理增强WAS发酵过程中VFAs生物转化和微生物相互作用的合作示意图。PF的Fe(VI)强氧化能够破坏污泥絮凝体结构和微生物细胞壁，而亚硝酸盐诱导的脂质过氧化可导致细胞膜损伤。这两种协同作用足以导致WAS絮凝体崩解和部分固体溶解。此外，PF+亚硝酸盐的共预处理能够提高水解酶(如蛋白酶和α-葡萄糖苷酶)的活性，对将污泥固体有机物分解为可生物降解的小分子有机物产生VFAs起到积极作用。

 

Fig. 8. The key microbes and their corresponding metabolic pathways for VFAs production during the co-pretreated (PF/nitrite=1/3)-WAS fermentation. 

    在发酵过程中，利用液相中的生物降解有机物通过不同的代谢途径转化为VFAs(如图8所示)。蛋白通过胞外水解酶(如蛋白酶/α-葡萄糖苷酶)可由多肽和二肽分解为氨基酸，而多糖则被降解为小分子单糖。氨基酸可以通过酶催化的分解代谢脱氨基生成乙酰辅酶a，也可以生成丙酮酸，即转化为乙酰辅酶a的中间产物。在磷酸转乙酰化酶和乙酸激酶的催化作用下，乙酰辅酶a可通过乙酰磷酸进一步转化为乙酸。

    同时，在本研究中，拟麦氏杆菌属和蛋白弹性菌属的乙酰辅酶A可以通过丁酸辅酶A、磷酸丁酸酯等中间体转化为丁酸。

 

Fig. 9. The evaluation of ET for boosting VFAs production executed by the redox cycle of Fe(II) and Fe(III) during WAS fermentation. A. Soluble iron changes; B. ET efficiency; C. Conversion efficiency of sludge SCOD to VFAs (PSCOD); D. the fitting equation of ET and PSCOD. E. CV profile comparison.

    测定了WAS发酵过程中PF+亚硝酸盐提高VFAs产量峰值的可溶性铁浓度。Fe(OH)3和NO3?在碱性条件下，可通过K2FeO4与NO2的化学反应生成，因此少量可溶性铁可以溶解（如图A所示）。然而，这种微溶性Fe（II）和Fe（III）通过其完成电子转移（ET）过程的价态转换，在提高VFA生物转化效率方面发挥了贡献作用（如图B所示）。这一结果也得到了VFAs转化效率（PSOD）变化的支持（图C），同时，线性拟合结果（图D）表明ET效率与PSCOD呈正相关。此外，CV曲线（图E）还表明，在共预处理（PF+亚硝酸盐）WAS发酵系统中，氧化还原性能明显增加。

 

 

小结

    本研究证明了PF和亚硝酸盐对促进WAS溶解和产酸发酵的协同作用。PF的Fe（VI）氧化和亚硝酸盐引起的脂质过氧化导致WAS溶解和VFA产生。同时，随着发酵后颗粒尺寸的增大，WAS的脱水能力也得到了提高。此外，共预处理提高了水解酶的活性，以实现更好的生物固体溶解。同时有助于提高假单胞菌、赤藓菌、嗜碱菌、拟麦球杆菌、变形杆菌、嗜碱杆菌、不动杆菌和青霉属等主要产生VFAs细菌的丰度，从而增强了微生物的产酸功能。此外，PF添加导致的电导率的改善可能在提高厌氧发酵中VFAs的生产效率方面发挥重要作用。

    第一作者：Xie Jiaqian

    通讯作者：辛晓东

    通讯单位：东莞理工大学

    论文DOI：10.1016/j.watres.2022.119287