结晶过程中晶种技术的最新进展

加晶种已经成为优化结晶行为、过程效率与产品质量的最关键工序之一。不一致的过滤速率、干燥时间、产量、体积密度、流动性与粒径分布经常由不一致的晶种与成核所致。在设计晶种策略时必须考虑许多参数，如：晶种粒径、晶种加入量（质量）与晶种添加温度。通常根据过程动力学以及所需最终颗粒物性对这些参数进行优化，这些参数在扩大生产与技术转移时必须保持一致。

通过在结晶过程中对晶种行为进行原位监测，可为晶种策略设计与放大生产提供巨大收益。在添加晶种之后的 15 到 30 分钟是确保晶种有效性的最关键时期。在线研究晶种行为通常对于确保按预期方式进行批量生产至关重要，了解晶种参数意味着需要较少的实验进行结晶优化。

更先进的晶种工艺的研究成果，将用于取代传统的方法。一种方法是通过成核与生长在过程中创建晶种床，同时利用在线颗粒定性（如：FBRM技术）控制粒径。这种方法在安全性至关重要的过程有明显优势。 本白皮书介绍关于设计晶种策略的最佳实践方法，以及对关于实时反馈控制粒径分布这一先进晶种方法的最新文章进行讨论。

通过晶种确保粒径分布一致性

提高批次结晶过程一致性的常用方法是引入晶种工序。晶种工序可提供在完全相同的温度或者批次时间点加入相同质量，粒径及晶型的晶种的工艺条件。因此，科研人员总体上可通过晶种确保不同批次的起点相同，从而提高过程的重复性。

但是，晶种过程可能引发出以前未考虑到的其他问题（工艺参数）：“应当添加多少晶种？”、“晶种粒径应当为多少以及应当在什么样的温度条件下添加晶种？”。为了解答这些问题，必须对结晶过程中晶种粒的功能进行考虑。简言之，通过添加晶种粒取代通过自发性成核将会生成的核/颗粒。晶种粒可提溶质晶体生长所需的表面。理想的结果是，在晶种之后，颗粒数量在批次中始终保持恒定（假设过程中不发生破损或者聚结）。例如，如果添加 1000 颗晶种粒，则在结晶结束后有望产生 1000 个颗粒。到此时为止，这些颗粒在尺寸上将会增大。实际上，成核过程是无法完全终止的，因为该过程与颗粒生长相同，与过饱和有关（如图 1）。因此，即使当存在晶种粒时，也始终会发生一定程度的成核现象。成核的程度与过程中过饱和发生速率有关，是对晶种 工序进行优化的关键参数。

那么，科研人员如何识别晶种工序将会对过程带来收益呢？在许多情况下，这相对简单。最终粒径分布不一致的过程经常会导致下游加工（如：过滤或干燥）效率低下。在这些情况下，不同批次中的晶种分布与成核点通常不同。引入晶种工序对于优化这些批次结晶过程至关重要。多形结晶过程也是晶种的主要备选方法，因为添加具有所需多形形态的晶种会大幅提高避免非理想形态的几率。

选择晶种条件（超饱和）

在确定过程应晶种之后，下一步将是确定添加晶种应当所在的温度或者时间点。这是MSZW（介稳区宽度）数据的重要应用所在。常规的经验是在溶解度曲线与介稳区之间的中途添加晶种颗粒。需要考虑的一个因素，尤其是在放大生产时需要考虑的一个因素是溶解度与热力学相关，和批次规模无关。而 MSZ 则与动力学有关，取决于规模并且受过饱和产生速率、传质、热传递以及是否存在固体或杂质影响 （还应指出溶解的杂质会对溶解度产生严重影响）。

这意味着在实验室内观察到的 MSZW 与在生产阶段观察到的 MSZW 不同，会在扩大生产期间造成问题。关于此方面的简单示例请见图 2。该数据用于从水中结晶的有机化合物。以固定的线性速率冷却。图 2a 显示以 15°C 温度冷却绝对清洁、无颗粒溶剂时的 MSZW。在图 2b 中，当达到饱和时添加 10 个大晶种晶体（重量小于 0.001g）。在此例中，比图 2a 提前 6°C 检测到成核点，这样 MSZW 为 9°C 而不是 15°C。在这一方面，即使是仅存在少量的晶种颗粒也会使 MSZ 大幅变窄。这是 在设计晶种温度时应当考虑的效应，否则添加晶种颗粒有可能因距离 MSZ 过近添加造成成核。由于溶剂中存在晶种颗粒已导致 MSZ 变窄。

如果在批次之间不对结晶容器进行彻底冲洗，则此效应还会极为严重。如果容器壁上挂有或者覆盖前一批次的残留物，则有可能对新溶液进行意外晶种，从而将 MSZW 缩小为先前观察到的水平，最糟糕的情况甚至是造成成核，从而导致批次之间存在巨大差异。Pfizer ²  提供的图 3 对连续三个生产批次介于 1μm 与 5μm 之间的 FBRM细粒数量进行比较。与 A 和 B 相比，批次 C 产生了极多的细粒。通过对 FBRM 趋势更仔细研究发现，在添加晶种之前，批次 C 已经有颗粒存在于溶液当中。这些颗粒有可能是由于意外自发性成核事件所致，抑或是先前批次残留在容器壁上的颗粒。无论是哪种情况，这些颗粒的存在均会导致批次产生比预期多得多的细粒，从而造成粒径不符合规格要求。

添加晶种所在的 MSZ 点（晶种温度）同样对于成核与生长的相对速度产生巨大影响（如图 4 与图 5 所示）。将来自于三次晶种实验的 FBRM结果进行比较，其中在 MSZ 的不同温度条件下（25°C、22.5°C 与 20°C）添加 0.25g 晶种。晶种颗粒的粒径分布完全相同，通过在每次实验添加晶种的数分钟后，由 FBRM 对弦长分布进行比较的方式对其表征。

图 4 对介于 1 至 20μm 之间的 FBRM细粒数量进行比较，这将提供相对成核速率。在靠近 MSZ (20°C) 的位置加晶种导致过饱和度达到最高水平，这造成成核速率达到最快程度，以及细粒数达到最高值。另一方面，在靠近溶解性曲线的位置加晶种以及当超饱和度低时，导致成核速率降低，细粒数达到最低值。图 5 显示每次实验的终点分布比较以及在隔离点处 (20°C) 的 PVM图像。在靠近 MSZ (20°C) 的位置加晶种会造成颗粒生长最小，当在溶解性曲线 (25°C) 附近晶种时，会造成最高的相对生长速率以及最多数量的大颗粒。该数据显示，可通过控制晶种温度实现生长或成核主导过程，这将会对最终粒径分布产生影响。

识别晶种加入与晶种粒径分布

需要考虑的另一方面是“需要添加多少晶种量？”以及“粒径应该为多少？”。事实上这取决于所需的最终粒径、多晶型或者是否存在与结晶相关的杂质问题。通常通过添加晶种来提供颗粒生长所需的表面面积（事实并非始终如此。有时，在靠近 MSZ 的位置添加少量晶种，以诱导成核）。所添加晶种的粒径与粒数决定可用表面面积。晶种颗粒通常很小，因为这可增加晶体生长的点数。如果需要大晶粒，则可能添加较少的晶种，因此很少晶粒的粒径会变得很大。另一方面，如果需要小晶粒，则需要加入较多的晶种，从而使更多数量的晶粒生长，这样每颗 晶粒只能少量生长。通常加入的晶种量少到 0.1 wt%，多达 5 wt%（甚至更多），具体取决于要求。在这一阶段需要指出的重要一点是：晶粒的粒径与粒数并非需要考虑的唯一参数。在添加晶种之后，过饱和生成速率（冷却速率或反溶剂添加速率）应当尽可能多地体现过程的生长动力。这将确保过饱和度自始至终始终保持在很低的水平，从而在最大限度减少成核的同时促进晶粒生长。

       为实现正确的粒径分布，经常将晶种粒进行研磨。这些研磨过的颗粒将具有断裂边缘与表面，这些有可能成为生长点，从而在一个晶种颗粒表面产生多个生长点。有时这会造成不理想的生长机制，从而产生结块的颗粒结构（如图 6 所示）。在添加研磨晶种十分钟之后，颗粒生长成为树枝状的结块结构，许多颗粒从单个晶体朝多个方向生长， 最终造成较小的晶体断裂与二次成核。这是一种不理想的生长机制，有可能在过滤和干燥过程中在下游产生其他问题并且导致不良的粉末处理物性。避免研磨晶种出现这种生长行为的一种方法是事先“愈合” 晶种颗粒。方法为：将晶种颗粒悬 浮于母液的饱和溶液中，然后混合 12 至 24 小时。在这段期间，晶体上的断裂表面将通过奥斯瓦尔德成熟过程修复，从而生成将有助于一致颗粒生长的具有光滑晶体表面的晶种颗粒。

此外，在添加晶种之后在恒温条件下等待一段时间也是很好的做法。这段等待时间的作用是留出充分的时间使晶种合理分散，以及通过生长消耗掉最初的溶液过饱和。这些等待时间通常可在进行实验室工艺开发期间进行定量。

但是在放大生产时，晶种分散动力会与在实验室中观察到的存在巨大不同。由于静电作用与内聚力的缘故，向溶剂内添加干粉晶种通常会导致粉末结块。久而久之，这些松弛的粘合力将会因搅拌所产生的湿润力与剪切力而分解。在扩大生产时，搅拌速度有可能减慢，从而产生与开发阶段所观察到的不同的流体动力环境和分散动力。图 7 显示 FBRM对大型结晶器内的晶种分散进行数据监测。如此例所示，晶种需要三个小时方可正确分散。因此，在进入过程的下一个工序之前，需要至少三个小时的恒温等待时间。相反，在实验室中，晶种分散需要不到一个小时的时间。这是实时监测如何确保即使在扩大生产期间过程不断优化与改进的良好示例。

晶种质量通常通过在天平上称量晶种的方式确定。当然，质量与粒径、粒数或表面面积无关。通常晶种粒径分布是用对于细粒摩擦和表面面积不太敏感的离线激光衍射或筛分来测量。这在实验室中通常是一个问题，因为晶种源很小，向容器内只能添加几克的研磨材料。然而，这却成为了放大生产非一致最大根源。在生产过程中，晶种源存储在一个较大的容器内，有可能向容器内添加数百克或者数千克的晶种。将晶种源进行隔离有可能导致不一致的晶种粒径。可通过在线粒径测量对此进行验证，此方法可在晶种之后对粒数分布情况进行数分钟的跟踪。如果最初的晶种粒数一致，并且晶种粒径与弦长分布一致，则终点粒径分布更有机会实现批次之间的一致性（图 8）。

晶种控制纯度与优化下游分离

Mousaw 等人 ³  描述了在对非对映中间化合物进行生产结晶期间执行晶种工序的重要性。由于存在不希望出现的非对映体（R 异构体），因此在生产过程中材料有时无法达到光学纯度规格要求。与合格的批次相比，不合格批次的过滤与干燥时间超长。使用所需的非对映体（S 异构体）进行晶种是结晶过程的重要步骤， 因为已知它可大幅提高动力学分辨率。然而在原始工艺中，晶种工序之后发生大规模二次成核事件，这一点通过在实验室中进行的 FBRM测量以及在生产阶段进行的浊度测量可以观察到。整个生产过程的结果表明，二次成核事件的温度可能与非对映过量直接相关 — 二次成核的温度越高，则非对映过量（产物纯度）越高。另外还观察到，较高的二次成核温度可大幅提高过滤与干燥速率，从而缩短过程循环时间（图 9）。

因此，这一二次成核温度被认定为需要控制的重要参数。通过在实验室与中试阶段进行的实验发现，混合速度与晶种表面面积对于确定二次成核的温度至关重要。事实表明，加入表面面积较大的晶种导致二次成核的温度升高。图 10 对晶种加入量较高与较低的实验室 FBRM数据进行比较。对于高速晶种加入而言，二次成核的温度为 43°C，这与很低的过饱和一致，因此属于相对较小的成核事件。另一方面，低晶种加入导致二次成核的温度为 18°C，这是过程中过饱和超高的一个点，因此造成 更大规模以及快速的成核事件，并且更多的细粒从溶液中结晶，这一点从 FBRM 的计数中可明显看出。该批次还具有很低的非对映过量以及需要较长的过滤时间。在生产阶段实施晶种加入量更高以及搅拌快速更快的重新设计过程时，在 39 个批次中没有观察到出现任何的不合格批次，平均离心时间从 7.5 个小时（旧过程）缩短至 2.2 个小时（新过程）。

先进的晶种方法与反馈控制

以往，晶种颗粒从外部来源添加，通常以粉末形式添加，而有时作为母液的饱和溶液或者适当反溶剂中的浆料添加。但是对于某些过程而言，主要是由于安全问题的缘故，尤其是鉴于操作高效材料时出现的安全问题，人们依旧不情愿晶种。使用外部来源晶种还会增加将一些意外的杂质引入过程中的可能性。可通过使用 FBRM在过程内部生成晶种颗粒的方式解决这些问题，以确保晶种床在粒径与数量方面一致。Chew et al ⁴ 推出了一种采用 FBRM 的自动化闭路反馈控制方法用于非晶种冷却结晶，以确保一致并且可重复的晶体产物质量。可通过图 11 查看此过程的典型温度曲线。此方法采用 FBRM在冷却期间 (B) 检测自发性成核初始点。当观察到总数连续四次增加（数量/秒， 1-1000μm）时，视为发生成核。此时，控制器触发以停止冷却，温度保持恒定 15 分钟，届时初次成核完成 (C)。然后温度以固定的速率升高，同时将通过 FBRM统计计算所得的方差系数 (C.V.) 用作{标准偏差/平均值}，以监测粒径分布变化情况。一旦达到预先设定的 C.V. 设定点，则表示达到目标晶种粒径分布，然后控制器启动最终冷却阶段 （图 11:D-E），此时温度以预先设定的恒定速率下降。根据外部晶种颗粒的典型 PSD（粒径分布）选择 C.V. 设定点。需要指出的是，加热速率（图 11：C-D）对批次时间产生重要影响。加热速率缓慢导致控制非常严格，但是由于批次时间过长，而加热速率过快，因此造成控制水平较低，而批次时间大幅缩短。因此选择 0.3°C/min 为加热速率，因为这被视为控制严格程度与批次时间之间的适当平衡。

图 12 清晰显示，与用于甘氨酸水系统的标准非晶种冷却结晶法相比，使用这种反馈控制方法所生成的最终产物在粒径分布一致性方面有着明显改进。通过观察发现，乙酰氨基酚水系统产生类似的结果，其水溶性远远低于甘氨酸。最近，Hermanto 等人 ⁵ 对这种反馈控制策略进行了扩展与改进，将其用于对甘氨酸水系统的反溶剂结晶，结果同样取得了成功。

这种方法的局限性在于需要对过程动力学具备一定程度的了解，以确定在成核（图 11：B-C）与冷却最终阶段（图 11：D-E）之后适合的等待时间。形成统一并且一致的晶种床作为起点非常重要，但是必须将晶种之后的冷却速率与生长动力学匹配，否则如果冷却速率过快，则通过二次成核有可能生成过量细粒。此外，这种方法无法清除通过机械 方式（如：磨损与断裂）可能生成的细粒，不过这是形成晶种床的非常简单与直观的方式，因此可消除使用传统晶种方法所产生的任何安全问题。

Abu Bakar 等人 ⁶  提出了一种被称为“直接成核控制”(DNC) 的反馈控制方法，使这一方法得到了改进。另外，这是一种非模型方法，在这一方法中，由 FBRM测量的粒数为直接控制区域。这一方法优于 Chew 等人 ⁴ 所提出方法的优点是不使用预先确定的加热或冷却剖面。在结晶过程中连续自动生成温度曲线，作为对成核事件所生成粒数的回应。（该原理同样适用于反溶剂结晶）。无需了解模型、过程动力学或者介稳区宽度，因为此方法通过利用反馈控制策略对介稳区限度进行连续实时检测，从而自动确定最佳的运行方式。图 13 表示此方法的典型运行方式。此方法在加热与冷却（或者溶剂与反溶剂添加）之间自动切换，以实现细粒成核或溶解，从而保持预先设定的 FBRM目标数量。结果，细粒连续生成与溶解，从而使计算的颗粒总数（数量/秒）始终保持在预先确定的范围之内。

此方法最初用于甘氨酸水系统反溶剂结晶。图 14a 所示为一个典型的曲线图，其中所有的 FBRM数量控制在预先确定值，即：2000 个颗粒 （数量/秒）。在过程的最初阶段，存在一定程度超量与欠量，然后系统最终达到预先确定的数量。最初发生的这一超量现象与初次成核事件所致数量增长过快有关。随后的成核事件（二次成核事件）在数量增长方面并非如此之快，因此更便于控制 与保持在预先设定的数值。图 14b 显示在整个结晶过程中，细粒数量保持相对恒定，而粗粒数量却稳步增加。这清晰显示生长是受控结晶过程中的主导机制。 

如图 15 所示，这种方法目前可提供一种以特定粒径或粒径分布为目标的方法。如果需要较小的颗粒，则可将结晶控制在更高的数量（如：4000 个/秒），如果需要较大颗粒，则应当将较少的数量（如：2000 个/秒）作为控制设定点。请注意一点：在此例中，FBRM总数用作控制设定点。因为是对由探头测量的颗粒总数进行计数，这或许不是是最佳统计方法。根据研究中的颗粒系统的尺寸与形状调整统计信息或许更为适合，如：使用介于 0 与 20μm 之间的计数控制细粒的成核与溶解。此外，与单单使用一个数值相比，将统计信息进行组合可提供更加准确的控制设定点。使用 Chew 等人4 所采用的加权均方或者方差系数会将一些尺寸信息引入控制设定点中，这会提高控制策略的精确度。

最近，Saleemi 等人 ⁷  实施这一方法以改进心血管活性药物成分 (API) 的最终粉末物性。最初的线性冷 却结晶产生了具有强烈气味的团聚颗粒，这种气味由于滞留在凝聚结构中的残留溶剂所致。较大的原生颗粒为配方过程的首选，因为人们发现在制造药品时，他们具有较为出色的流动与压缩特性，另外它还可去除滞留残留溶剂发出的气味。尽管可利用温度循环法后期结晶解决气味与粒径难题，但是所需的循环次数以及最高和最低温度与加热/制冷速率全部通过一系列的反复实验确定。自动化直接成核控制方法通过一次实验即可确定结晶过程中所需进行的温度循环次数，与传统的线性制冷过程相比，可生成一种在粒径与结块方面质量出色的产物（不发生结块，因此不存在产生气味的滞留残留溶剂）。因此，这种方法由于省去了过程优化所需的长时间反复实验，因此可大幅缩短开发时间。

结论

采用晶种工序是实现批量结晶过程高度一致性与重复性的有效方法。在设计晶种工序时需要考虑诸多的晶种变量，以确保其成功实施。在添加晶种之后的 15 到 30 分钟是确保晶种有效性的最关键时期。由于这段时期通常处于高温与过饱和条件下，这给采样造成了很大的难度，因此原位监测晶种行为通常在这段时期至关重要。这在新过程放大期间尤为重要，因为过程中的流体动力与实验室内所观察到的流体动力之间存在着一定差异，这会影响到晶种分散动力效果以及成核与生长速率。通过放大方法确定晶种行为会很大程度上提高成功的概率，并且无需因意外过程行为通过额外的缩小实验提高认知度与 优化。实时监测粒径与粒数可将晶种床创建于过程当中，并且可对晶种床直接进行反馈控制，从而瞄向希望得到的下游及粉末物性，并且具有特定粒径分布的最终产物。