水质对生物黏泥胞外聚合物成分的影响

水质对生物黏泥胞外聚合物成分的影响
刘芳1，侯衍美2，赵朝成1，王永强1，夏璐1
(1．中国石油大学化学化工学院，山东青岛266555；2．海工英派尔工程有限公司，山东青岛266061)
摘要：针对循环冷却水补充水的水质特点，采用单因素实验方法分别考察了营养物质(BOD5，NH4+-N，TP)、颗粒物(CaCO3)、矿物质(Ca2+，Mg2+，Na+，Fe3+)等因素对生物黏泥胞外聚合物成分的影响。研究结果表明：循环冷却水系统生物黏泥胞外聚合物主要由多糖构成；控制营养物质达到C(BOD5)≤5 mg／L，c(NH4+一N)≤6 m g/L，c(TP)≤lmg/L，颗粒物满足c(CaC03)≤40 mg／L，矿物质满足c(Ca2+)≤210 mg／L，c(Mg2+)为85～185 mg/L，c(Na+)≤120mg／L，c(Fe3+)≤1 mg／L，可使生物膜中的胞外聚合物(EPS)含量最少。
关键词：循环冷却水；胞外聚合物；营养物质；颗粒物；矿物质
中图分类号：TQ 085；TB 304 文献标识码：A
炼油废水富含有机物和各种离子，可以提供微生物生长必需的营养成分。细菌在牛命活动中会向细胞外分泌大量的粘性物质，这些粘性物质会与水中的无机盐悬浮物、沙粒、藻类等物质和微生物黏附在一起，从而形成生物黏泥。生物黏泥会引起传热效率降低、管道堵塞、结垢腐蚀加剧等。胞外聚合物(EPS)主要来源于细胞内分泌、细胞自溶和水中吸附。由于EPS是生物黏泥最主要的成分，其组成和数量会影响生物黏泥的强度、吸水性、空隙率、吸附性和微牛物代谢活性等。EPS的组成比较复杂，多糖和蛋白质约占EPS总量的70％～80％，含量较低的腐殖质、核酸、糖醛酸、脂类和氨基酸等也是EPS中常见的物质。在小同基质条件下形成的生物黏泥的化学组成不同，导致EPS的化学组成也存在一些差异。笔者就营养物质(BOD5，NH4+一N，TP)、颗粒物(CaCO3)和矿物质(Ca2+，Mg2+，Na+，Fe3+)对生物黏泥EPS成分的影响进行研究，为进一步研究炼油废水回用于循环冷却水时生物黏泥的控制问题奠定基础。
1 实验
1．1生物黏泥的培养
实验所用装置为江苏省高邮市摩天电子仪器有限公司生产的RCC—II型旋转腐蚀挂片实验仪，采用A3碳钢挂片，在挂片上培养生物黏泥。主要实验条件：水温(35±1)℃，试片旋转速度75 r／min。营养水质用葡萄糖作碳源(葡萄糖与BOD5的质量比为1：0．6)，以硫酸铵((NH4)2SO4)作氮源，以磷酸氢二钠(Na2HP04)作磷源。用自来水配置营养液，补充微量元素(如钙、镁、钠等)，并根据不同的水质要求，投加不同的无机盐。投入菌种后，用曝气机曝气10 h，停止曝气后静置l～2 h，换水排掉悬浮态细菌，再按要求加人营养液，重复上述操作。以12 h为一个培养周期，直到生物膜长到合适的厚度。
菌种来源为胜华炼油厂循环冷却水系统凉水塔下面的集水池。接种水和自来水水质测定方法及测定值如表1所示。

1．2分析测定方法
1．2．1 胞外聚合物的提取
采用甲醛一氢氧化钠法提取生物黏泥的胞外聚合物。具体方法如下：(1)剥落。取3片挂片连同50 mL去离子水一起放入烧杯中，用超声波震荡约10 min；(2)洗脱。将50 mL黏泥样品离心5 min(8000 r／min)后撇去上清液，向黏泥小球中加入缓冲溶液(2 mmol／L Na3P04，4 mmol／L NaH2P04，9mmol／L NaCI和l mmol／L KCI，pH值为10)，使其体积恢复到50 mL；(3)提取。加入0．3 mL甲醛，300r／min下搅拌0．5 h，再加入50 mL 0．04 mol／L的NaOH溶液，继续搅拌1 h，离心10～20 min；(4)过滤。取离心后的上清液用微孔滤膜过滤，取清液待测。
1．2．2胞外聚合物成分的测定
(1)多糖的测定。采用总酮一硫酸法。高温下糖类会被浓H2SO4脱水生成糠醛或糠醛衍生物，并与蒽酮(C14H10O)缩合成蓝色化合物，在620 nm处呈现最大光吸收。
具体方法如下：配制一系列标准糖溶液，分别量取蒽酮试剂4 mL和标准糖液1 mL置于试管中，迅速浸于冰浴中冷却，然后沸水浴上加热10 min(加盖，防止水蒸发、损失)，冷却，620 nm下，用721型分光光度计对空白样品(以1 mL H2O代替糖液)测定吸光度，做出葡萄糖标准曲线。测定样品的A620以葡萄糖的标准曲线可换算出糖的含量。将结果折算成单位表面积挂片上的多糖含量。
(2)蛋白质的测定。蛋白质测定采用Bradford(考马斯亮蓝法)。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后颜色由红色转变为蓝色，在595 nm处产生最大光吸收。
具体方法如下：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0．15mol／L的NaCl配制成1，0．1 g／L的蛋白溶液。分别做出常量蛋白质标准曲线和微量蛋白质标准曲线。
取合适的未知样品体积(使其测定值在标准曲线的直线范围内)进行测定，根据测定的A595值，以蛋白质标准曲线换算出蛋白质的含量。将结果折算成单位表面积挂片上的蛋白质含量。
2 结果分析
2．1循环冷却水中营养物质对EPS的影响
分别配制小同的营养水质，考察有机碳源、氮源、磷源对生物黏泥EPS含量的影响。根据(污水)再生水用作冷却用水的建议水质标准中的水质要求，来确定其中两种营养的加入量，改变第3种的加入量。考察有机碳的影响时，控制NH4+一N和TP质量浓度分别为10，l mg／L；考察氮源的影响时，控制BOD5和TP质量浓度为10，l mg／L；考察磷源的影响时，控制BOD5和NH4+一N质量浓度为10，10mg／L。
提取生物黏泥的胞外聚合物，测定其中的多糖和蛋白质含量。分别做出多糖、蛋白质及EPS总量随BOD5，NH4+-N，TP质量浓度的变化曲线，见图l。

由图1可以看出，生物黏泥EPS中含量最高的物质是多糖。但是，也有一部分关于生物膜中EPs的研究显示，蛋白质是胞外聚合物中主要成分。这种差异可能是由于研究者利用的提取方法不同造成的，目前对于EPS的提取并没有一种标准方法。
从图1中还可以看出，随BOD5，NH4+-N，TP质量浓度的增加，EPS含量呈现出先减小后增大的趋势，且在c(BOD5)≤5 mg／L，c(NH4+一N)≤6 mg/L，c(TP)≤1 mg／L时，多糖、蛋白质及EPS总量较少。
水中的葡萄糖是细菌生长的碳源和能源，碳素是构成菌体成分的主要元素，又是产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的重要原料；NH4+一N是细菌生长所需的氮源和能源；磷是微生物细胞中含量较高的元素，是核酸、磷脂和辅酶的成分，参与碳水化合物代谢的磷酸化过程，生成高能磷酸化合物，高能磷酸键有贮存和传递能量的功能，磷酸盐又是再要的pH缓冲剂。碳、氮、磷作为微生物生长所需要的重要的营养元素，对细菌生长具有限制性作用。在高营养时细菌分裂繁殖加快，使微生物数量增加，所以细菌所分泌的胞外聚合物较多。供细菌生长的营养物减少时，微生物的生长受到营养物的限制，微生物所分泌的胞外聚合物也随之减少；但当营养物减少到一定程度时微生物进入内源呼吸阶段以维持生存，导致细菌会因自身物质消耗太多而发生自融，使细菌体内的残余多糖和蛋白物质流出，而使胞外聚合物中的多糖和蛋白质含量增加。这与周健等的研究相类似。另一方面，有研究表明，在不同营养条件下，生物黏泥中的优势微生物种群会有所不同，从而使微生物分泌的胞外聚合物成分有一些差异。这可能也是影响曲线局部出现小波动的原因。
研究表明，碳源、氮源不足，磷充足的情况下，过量的磷对微生物的生长没有影响。
2．2循环冷却水中颗粒物对生物膜成分的影响
配制不同的营养水质，控制BOD5，NH4+-N，TP质量浓度分别为10，10和l mg／L，分别考察不同的颗粒物(CaCO3)质最浓度对生物黏泥性能及成分的影响。生物黏泥的多糖、蛋白质及EPS总量随Ca—CO3质量浓度的变化曲线见图2。

由图2可以看出，随着颗粒物质量浓度的增加挂片中胞外聚合物的多糖、蛋白质先增加，后减少。
在CaCO3质量浓度小于40 mg／L时，颗粒物的存在对生物黏泥成分的影响较小，当CaCO3质量浓度大于40 mg／L时，随CaCO3质量浓度的增加，生物黏泥的EPS各成分的含量显著增加。CaCO3质量浓度在120 mg／L左右时，多糖、蛋白质及EPS总量最多。
颗粒有很好的吸附性和离子交换性，无机颗粒物的加入能给微生物提供更多的附着点，而且营养物质易吸附在颗粒物表面，这使得微生物和营养物质的接触机会增大，而且黏泥颗粒的介入增强了矿物质在生物膜内的传质系数，有利于微生物对营养物质的吸收；另一方面，生物黏泥中的胞外聚合物黏附性能较强，很容易将颗粒物引入到生物黏泥中，所以黏土颗粒除了对生物黏泥的物理结构有一定影响外，还可以使生物黏泥内部保持适宜的pH值。随着颗粒物质量浓度的增加，生物黏泥为微生物提供了更加适宜其生存的物理结构和环境条件，促进微生物生长。微生物增加，生物黏泥中的胞外聚合物随之增加，EPS由于具有较强的粘附性能，能很容易将颗粒物引入到生物黏泥中，从而义促进生物黏泥生长。但是，当CaCO3质量浓度大于120mg／L时，生物黏泥EPS各成分的含量，随CaCO3质量浓度的增加而下降。其原因在于随着水中颗粒物的增加，在一定的水流速度下，颗粒物对生物黏泥的冲刷作用加大，不利于生物黏泥生长，EPS含量随之减少。
2．3循环冷却水中矿物质对生物膜成分的影响
配制不同的营养水质，控制BOD5，NH4+-N，TP质量浓度分别为10，10和1 mg／L，分别考察不同的钙离子、镁离子、钠离子、铁离子质量浓度对生物黏泥性能及成分的影响。
生物黏泥的多糖、蛋白质及EPS总量随Ca2+，Mg2+，Na+，Fe3+质量浓度的变化曲线见图3～6。

由图3可以看出，随着钙离子质量浓度的增加，生物黏泥EPS各成分的含量增加。当钙离子质量浓度小于210 mg／L时，随Ca2+质量浓度增加，生物黏泥EPS各成分的含量增加缓慢，EPS含量控制在较低水平。当钙离子质量浓度大于260 mg／L后，生物黏泥EPS各成分的含量快速增加。
钙以离子状态控制着细胞的生理状态，如降低细胞质膜透性，调节酸度等，并对淀粉酶及蛋白酶等胞外酶活性的稳定有重要影响。当钙离子质量浓度小于210 mg／L时，较低的钙离子水平会限制微生物生长，同时，循环水中有一定钙离子有利于缓蚀。钙离子作为细菌生长所必需的元素，当质量浓度大于210 mg／L后，在实验的质量浓度范围内，钙离子的增加可促进细菌的快速生长，EPS含量也快速增加。另外，Ca2+可以与EPS中带负电的基团结合，在EPS之间或EPS与微牛物之间起架桥作用，有助于生物黏泥的形成，从而使EPS增加。这与周健等的研究相类似。此外，郦和生等研究发现，Ca2+对铁细菌生长有促进作用，而对异养菌的生长没影响。这意味着随着Ca2+质量浓度的增加，铁细菌越来越占优势，而使生物膜逐渐由多种群共生向单一种群占优势发展。这一点町由实验中生物黏泥的形态结构说明：铁细菌的大量存在会在细菌外膜沉淀Fe(OH)3，而形成大量黏泥沉积物。因此，种群结构的变化也会对EPS成分产生一定影响。

由图4可以看出，随着镁离子质量浓度的增加，生物黏泥EPS各成分的含量呈先下降后上升的趋势。镁离子质量浓度在85—185 mg／L时，生物黏泥EPS各成分的含量均达到较低值。
当镁离子质量浓度在35～135 mg／L时，随着镁离子质量浓度的增加，生物黏泥EPS各成分的含量减少。原因在于镁是细菌叶绿素的组成元素和多种酶的激活剂，能以离子态激活固氮酶、蛋白酶、磷酸化酶和磷酸激酶等。镁还能促进氨基酸活化，有利于蛋白质的合成，对微生物生长具有重要的作用。大部分细菌最适镁离子质量浓度为0．001mol／L(24 mg／L)，实验中配水用的自来水中镁的本底值约为35 mg／L，因此镁离子的增加反而不利于细菌生长，EPS各成分的含量减少。
当Mg2+质量浓度大于135 mg／L以后，随Mg2+质量浓度增加，生物黏泥EPS各成分的含量增加。
这主要是因为循环水中存在如下平衡：Mg2++2HC03一=Mg(OH)2+2C02，镁离子质量浓度过高，极易成垢，对黏泥生成有促进作用，从而促进细菌生长。因此，控制镁离子质量浓度在85～185 mg／L时，EPS含量最少。

由图5可以看出，当钠离子质量浓度小于150mg／L时，随着钠离子质量浓度的增加，生物黏泥EPS各成分的含量均为增大趋势，当钠离子质量浓度大于150 mg／L时，随钠离子质量浓度的增加，3者呈下降趋势。由不加钠盐的当地自来水配制的营养液中(C(Na+)=103 mg／L)EPS各成分的含量最少。
钠主要参与细胞渗透压的调节。钠离子质量浓度较低时，溶液的渗透压小于细菌细胞内渗透压，低渗溶液会使细胞吸水膨胀，对细胞肇脆弱或丧失的各种缺壁细胞(如原生质体、球状体、支原体)来说，在低渗溶液中还会破裂。因此钠离子质量浓度太低，对细菌生长不利。随着钠离子质量浓度的增加，溶液环境越来越适宜细菌生长，EPS各成分的含量均增大。
当溶液的渗透压大于细菌细胞内渗透压时，高渗溶液会使细胞失水，严重时发生质壁分离，也对细菌生长不利，EPS各成分的含量随细菌减少而减少。因此，钠离子质量浓度小于120 mg／L时，EPS含量较低。
由图6可以看出：铁离子质量浓度小于2 mg／L时，随铁离子质量浓度增加，生物黏泥EPS各成分的含量均增加；铁离子质量浓度达到2 mg／L时，EPS的含量最大；当铁离子质量浓度大于2 mg／L时，随铁离子质量浓度增加，生物黏泥EPS各成分的含量趋于稳定；铁离子质量浓度小于l mg／L时，生物黏泥EPS各成分的含量维持在较低的水平。
铁是微生物生长所必需的元素，所有微生物都离不开铁，铁为细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基及铁卟啉的组成部分，缺铁时，这些酶类的合成将受影响。因此铁质量浓度低时，微生物的生长受到限制，EPS含量较少。随铁质量浓度增加，微生物慢慢滋生。在铁离子质量浓度达到2 mg／L时，测得烧杯中水的pH值为8．1，此时铁发生吸氧腐蚀生成Fe(OH)3，并形成铁锈，铁锈颗粒的带入有效促进了黏泥中细菌的生长，尤其是嗜铁细菌快速生长。当铁离子质量浓度达到3 mg／L以后，可能由于微生物种群结构趋于稳定，铁离子的增加不再引起细菌数量大的波动，EPS含量也趋于稳定。控制Fe3+质量浓度低于1 mg／L时，生物黏泥EPS各成分的含量较低。

3 结论
(1)在考察的营养物质、颗粒物、矿物质质量浓度范围内，生物黏泥EPS的成分主要是多糖。
(2)营养物质(BOD5、NH4+-N、TP)对生物黏泥的成分有较明显的影响。随BOD5，NH4+-N，TP含量的增加，EPS含量呈现出先减小后增大的趋势。c(BOD5)≤5 mg／L，c(NH4+一N)≤6 mg／L，c(TP)≤1 mg／L时，多糖、蛋白质及EPS总量较少。
(3)在CaCO3质量浓度低于40 mg／L时，颗粒物的存在对EPS影响较小，EPS含量控制在较低水平；当CaCO3质量浓度高于40 mg／L时，随CaC03质量浓度的增加，EPS含量显著增加。
(4)各种矿物质对生物黏泥性能产生不同影响。当水中c(Ca2+)≤210 mg／L，c(Mg2+)为85～185 mg／L，C(Na+)≤120 mg／L，C(Fe3+)≤1 mg／L时，EPS含量较少。