低频电磁场对成骨细胞增殖及细胞周期的影响

汤青 赵南明*
单位：清华大学生物膜与膜生物国家重点实验室, 生物科学与技术系, 北京100084.
* 联系人 1998-11-10收稿，1999-04-21收修改稿
致谢 感谢戴尧仁教授在本文写作中给予的热心帮助.


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摘要 鼠的原代成骨细胞, ROS成骨样细胞受50 Hz低频电磁场作用以后, 应用MTT方法和流式细胞术, 检测细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡情况. 结果表明: 低频电磁场作用后的细胞, 与对照组细胞相比, 细胞数目增多, S期细胞百分比增高, 凋亡比例减少. 说明低频电磁场的生物学效应的一个重要方面表现在对细胞增殖、细胞周期的影响上.

关键词 低频电磁场 生物学效应 细胞增殖 细胞周期


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我们生活的空间中存在着各种电磁场. 近年来, 对电磁场生物学效应的研究日益引起人们的关注［1～5］. 一些病理学上的研究发现, 高压输电线周围的居民癌症的发病率较高可能与电磁场的辐射有关［6,7］. 与此同时, 人们又发现, 一定强度的低频交变或脉冲电磁场能够促进患者骨折的愈合［8］, 医学上还常常将电磁场(如高频电磁场)的热效应用于组织疼痛的透热疗法和肿瘤的高温治疗. 但是电磁场的作用机理还不很清楚, 电磁场的一些生物学效应尚无被广泛接受的机理解释.

低频电磁场促进骨折愈合, 可能的原因是低频电磁场对成骨细胞有一定的影响. 本文利用Helmholtz线圈产生的低频交变电磁场作为模拟生活中的电磁场, 来研究低频电磁场对成骨细胞增殖的影响, 并初步探索了对成骨细胞周期的影响.


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1 材料与方法

(ⅰ) 细胞培养. 鼠的原代成骨细胞取自SD乳鼠的颅骨［9］, 用含10%胎牛血清 (GIBCO BRL 公司) 的α-MEM 培养液培养于37℃, 5% CO2培养箱中. ROS成骨样细胞 (北京协和医科大学周学瀛教授赠) 也用α-MEM 培养液培养. 2～3 d换一次液.

(ⅱ) 低频电磁场的产生. 低频交变电磁场作用装置由两部分组成. 一部分是交变电流发生部分, 能够产生频率0～1 MHz可调, 电流0～0.6 A可调的正弦交变电流; 一部分是Helmholtz兹线圈. Helmholtz线圈由2个平行且共轴的圆线圈组成, 且其线圈间距a等于线圈半径R. 当在2个线圈中通以同方向电流I时, 则其总磁场在轴的中点附近的较大范围内是均匀的, 为: B=μ0N0I/2R, 其中μ0=4π×10-7 H/m为真空磁导率. 本实验中, 线圈 R=10.9 cm, 每个线圈匝数N0=500, 则B=2.88 I(mT). 因为在电磁场促进骨折愈合的实际应用中, 其电磁场强度在mT量级左右, 因此在下面的实验中我们通以0.4 A交变电流, 产生1.15 mT的电磁场, 对成骨细胞进行作用.

(ⅲ) 低频电磁场对细胞的作用. 细胞在培养瓶或培养板中贴壁培养. 当细胞生长处于对数生长期时, 将培养瓶或培养板放置于Helmholtz兹线圈中, 使底部处于线圈中心轴平面上. 两线圈串联, 并通以50 Hz, 0.4 A的电流, 作用30 min后切断电源. 对照组细胞不加低频电磁场作用. 细胞继续培养一段时间后用MTT方法检测细胞增殖情况, 或用流式细胞术 (Flow Cytometry, FCM) 测定细胞周期.

(ⅳ) MTT方法检测细胞存活数. MTT (3-［4,5-Dimethylthioazol-2-yl］-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue)法测定是一个快速简便的颜色反应的测定［10］. 其原理是哺乳类动物细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄绿色的MTT降解成蓝紫色的甲, 再用酶联免疫检测仪测定甲的含量就可以定量测定细胞的存活总数.

测量之前需先做MTT的标准曲线. 将细胞按一定数目接种于96孔培养板内, 培养36 h后, 于各小孔内分别加入5 mg/mL MTT溶液0.02 mL. 然后将培养板送回培养箱内培养5 h. 取出培养板后, 吸尽孔内培养液, 加入0.2 mL二甲基亚砜 (Dimethyl sulphoxide, DMSO), 振摇培养板10 min左右. 最后用酶联免疫检测仪测定光密度 (490 nm), 做出光密度与细胞存活总数的标准曲线.

根据MTT标准曲线, 可得到各细胞的最佳接种数目. 按其数目接种于96孔培养板内. 采用50 Hz, 0.4 A电流驱动Helmholtz兹线圈, 使低频电磁场作用于细胞20 min. 然后培养36 h, 再按做MTT检测的标准方法操作, 测定出细胞的存活总数. 同时做对照组.

(ⅴ) 流式细胞术测定细胞周期. 流式细胞术是以流式细胞仪为工具来完成细胞等生物粒子理化特性研究的重要方法. 它可以在单细胞水平上对大量细胞进行快速, 准确, 多参数的定量分析及分选.

培养瓶中细胞在Helmholtz线圈的低频电磁场中作用20 min后继续培养24 h. 然后用0. 25%胰蛋白酶消化收集各组细胞, 300目尼龙网过滤以去除细胞团块, 用磷酸盐缓冲液 (PBS, pH=7.4) 按1×106/mL细胞密度悬浮细胞.