回流比对厌氧氨氧化系统的影响及作用机制研究

回流比对厌氧氨氧化系统的影响及作用机制研究

目前，硝化-反硝化及其衍生工艺是应用最广泛的污水生物脱氮技术，然而，该类工艺在运行过程存在曝气能耗高、剩余污泥量多、反硝化碳源投加量大和温室气体N₂O排放量大等突出问题，难以适应“碳达峰、碳中和”战略目标下对污水处理过程的低碳化要求^［1］。与其相比，厌氧氨氧化因其无需外加反硝化碳源、曝气能耗低、剩余污泥产量少和温室气体排放量少等显著的优势，成为当前污水生物脱氮领域的研究热点^［2］。厌氧氨氧化是厌氧氨氧化菌将氨氮（NH₄⁺）和亚硝态氮（NO₂^-）按照一定的比例（1∶1.32）直接转化为氮气（N₂）的过程。其中回流比作为厌氧氨氧化系统运行中的关键控制参数，对系统内的氧环境、底物浓度和泥水混合效果等影响较大，导致系统内菌群结构发生演变，进而影响系统的脱氮性能^［3］。目前提高厌氧氨氧化系统脱氮性能的研究主要集中在生物炭^［4］、金属离子^［5］和群体感应介导^［6］等方面，同时增加回流对厌氧氨氧化系统的促进作用已被证实。傅慧敏等^［7］研究了出水回流对颗粒污泥结构和功能的影响，发现出水回流增加了颗粒污泥活性和孔隙率，改善了厌氧氨氧化系统的水力条件和传质效应。Zhang等^［8］研究发现，出水回流降低了亚硝态氮积累对短程硝化/厌氧氨氧化系统的不利影响，增加了厌氧氨氧化菌的相对丰度。此外在探究出水回流对反硝化-部分亚硝化-厌氧氨氧化耦合工艺处理中晚期垃圾渗滤液的影响时，发现适宜的回流比可形成有利于功能菌生长的环境^［9］。而在处理有机废水时，通过回流的稀释作用可以减缓有机抑制剂对厌氧氨氧化菌的毒性作用，并且可以减少电子竞争，促进氮的有效转化^［10］。但以上研究并未涉及系统氧环境、功能基因表达和作用机制分析等方面，且关于系统脱氮性能和颗粒污泥特性的研究也不够全面，同时回流比对不同反应器类型厌氧氨氧化系统的影响也无法进行有效类比。基于上述情况，本研究通过调控回流比这一关键运行参数，系统探讨了其对UASB（升流式厌氧污泥床）型厌氧氨氧化系统脱氮性能（氨氮、亚硝态氮和总氮的去除及硝态氮的生成）和系统氧化还原电位的影响规律，并分析了颗粒污泥的物理特性（例如：形态、粒径和沉降性能）和化学组成（例如：胞外聚合物组分及含量、官能团种类）的变化规律。进一步结合高通量测序技术，解析了微生物群落结构（门和属水平）的演替特征及氮代谢关键功能基因的表达变化。从宏观性能、微观形态及分子生物学水平全面揭示了回流比对厌氧氨氧化系统的多重作用机制，为进一步提高厌氧氨氧化系统的脱氮性能和稳定运行提供理论基础。

一、 材料与方法

1. 材料

（1） 实验装置：本实验采用的UASB反应器由PVC制成，下部反应区内径和高度分别为55 mm和500 mm，上部三相分离区内径和高度分别为81.4 mm和150 mm，有效体积为2 L。进出水方式采用下进上出，上部出水口和排气口处设置水封，出水口至进水口处设置回流管。反应器外部包裹加热膜和黑色保温材料，进行保温和避光。装置示意图如图1所示。图1   UASB装置示意图Fig. 1   Schematic diagram of UASB device1.

2. 实验用水：实验用水为人工配制，模拟稀土矿山尾水经过部分短程硝化后的出水，成分为（mg/L）：氨氮88.05-110.27，亚硝态氮112.66-149.74，KH₂PO₄ 2.00，CaCl₂·2H₂O 20.00，MgSO₄·7H₂O 20.00，NaHCO₃ 110.00，微量元素Ⅰ、Ⅱ的投加量都为1 mL/L。微量元素Ⅰ组成为（mg/L）：EDTA 5 000，FeSO₄ 5 000。微量元素Ⅱ组成为（mg/L）：EDTA 15 000，H₃BO₄ 14，MnCl₂·4H₂O 990，CuSO₄·5H₂O 250，ZnSO₄·7H₂O 430，NaSeO₄·10H₂O 210，NaMoO₄·2H₂O 220，CoC1₂ 240，NiCl₂·6H₂O 190。

（3） 装置运行：反应器的水力停留时间为12 h，反应器内温度为33-35 ℃，根据回流比的不同，将整个运行过程分为3个阶段：第Ⅰ阶段（第1-25天）回流比为0%（R1），第Ⅱ阶段（第26-52天）回流比为50%（R2），第Ⅲ阶段（第53-85天）回流比为100%（R3）。

2.方法

（1）分析项目与测定方法：氨氮：纳氏试剂光度法；亚硝态氮：N-（1-萘基）-乙二胺光度法；硝态氮：紫外分光光度法；氧化还原电位：氧化还原电位测定仪；蛋白质（PN）：考马斯亮蓝法；多糖（PS）：苯酚-硫酸法；污泥表面官能团：傅里叶红外光谱仪（扫描范围为4 000-400 cm^-1，分辨率为8 cm^-1）。

（2）微生物特性分析：在反应器运行到25、52和85 d时，分别取出厌氧氨氧化颗粒污泥，冷冻处理后寄往生工生物工程（上海）股份有限公司。使用OMEGA试剂盒提取污泥中的DNA，测序平台为 Miseq，每个样品的测序数据量平均为6万条reads，扩增区域为细菌16S V3-V4，引物为：上游（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG），下游（805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC）。其中PCR扩增分为第一轮PCR扩增和第二轮扩增（引入Illumina桥式PCR兼容引物），第一轮扩增中PCR反应条件：94 ℃， 3 min→（94 ℃，30 s→45 ℃，20 s→65 ℃，30 s）₅→（94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s）₂₀→72 ℃，5 min→10 ℃，∞；第二轮扩增PCR反应条件：95 ℃，3 min→（94 ℃，20 s→55 ℃，20 s→72 ℃，30 s）₅→72 ℃，5 min→10 ℃，∞。

二、结果

1. 氮的转化和去除

不同回流比下厌氧氨氧化系统中氮的转化和去除情况如图2所示。由图2可以看出，当回流比为0%时，系统中的氨氮去除率为66.46%-88.39%，亚硝态氮去除率为56.24%-98.93%，出水硝态氮浓度为42.15-53.95 mg/L，总氮去除率为38.48%-69.92%，平均NRR为280.51 mg/（L?d）。当回流比为50%时，系统中的氨氮去除率呈升高趋势，亚硝态氮去除率稳定在90%以上，出水硝态氮浓度为22.81-69.23 mg/L，总氮去除率为56.06%-76.54%，平均NRR为301.24 mg/（L?d），系统脱氮性能有所提升。当回流比为100%时，初期系统中的氨氮、亚硝态氮和总氮去除率都显著下降，这主要是因为此时回流比进一步增加为100%，系统受到的水力冲击较大，短时间内难以调整适应。之后系统脱氮性能逐渐提高并趋于稳定，后期稳定运行阶段（71-85 d），系统中的氨氮、亚硝态氮和总氮平均去除率分别为86.29%、93.55%、71.93%，出水硝态氮平均浓度为40.12 mg/L，平均NRR为316.59 mg/（L?d）。图2   不同回流比下氮的转化和去除Fig. 2   Nitrogen transformation and removal under different recirculation ratios

A：氨氮的变化；B：亚硝态氮的变化；C：硝态氮和总氮的变化；D：NLR和NRR的变化

A: Changes in ammonia nitrogen; B: Changes in nitrite nitrogen; C: Changes in nitrate nitrogen and total nitrogen; D: Changes in NLR and NRR

2.化学计量比和氧化还原电位的变化

不同回流比下厌氧氨氧化系统中化学计量比和氧化还原电位的变化情况如图3所示。由图3可以看出，当回流比为0%时，系统中的?NO₂^--N/?NH₄⁺-N为0.87-2.06，且大多数情况下高于厌氧氨氧化理论值，?NO₃^--N/?NH₄⁺-N为0.36-0.74，也高于厌氧氨氧化理论值，同时出水氧化还原电位高于进水。当回流比为50%时，系统中的?NO₂^--N/?NH₄⁺-N和?NO₃^--N/?NH₄⁺-N总体呈降低趋势，出水氧化还原电位高于进水且差值减小。当回流比为100%时，系统中的?NO₂^--N/?NH₄⁺-N和?NO₃^--N/?NH₄⁺-N进一步呈降低趋势，并接近厌氧氨氧化理论值，同时出水氧化还原电位逐渐低于进水。图3   不同回流比下化学计量比和氧化还原电位的变化Fig. 3   Variations in stoichiometric ratios and oxidation-reduction potential under different recirculation ratios

A：化学计量比的变化；B：氧化还原电位的变化

A: Changes in stoichiometric ratio; B: Changes in redox potential

3.污泥表面形态的变化

不同回流比下厌氧氨氧化系统中污泥表面形态的变化情况如图4所示。由图4可以看出，当回流比为0%时，系统中污泥外观上呈现为红褐色，形态上包括絮状和颗粒状，颗粒污泥之间边界清晰，颗粒饱满。当回流比为50%和100%时，系统中污泥的颜色逐渐变红，粒径逐渐增大，颗粒化程度进一步提高，颗粒污泥表面更加光滑，且回流比为100%时系统中颗粒污泥上浮现象明显减少。图4   不同回流比下污泥表面形态的变化Fig. 4   Variations in granule sludge surface morphology under different recirculation ratios

A：回流比为0%的污泥；B：回流比为50%的污泥；C：回流比为100%的污泥

A: Sludge with a reflux ratio of 0%; B: Sludge with a reflux ratio of 50%; C: Sludge with a reflux ratio of 100%

4.污泥EPS组分及含量的变化

不同回流比下厌氧氨氧化系统中污泥EPS组分及含量的变化情况如图5所示。由图5可以看出，当回流比为0%时，系统中污泥的松散型EPS高于紧密型EPS，并且多糖含量大于蛋白质。当回流比为50%时，系统中污泥的紧密型蛋白质（TB-PN）含量减少了9.07 mg/gVSS，松散型多糖（LB-PS）含量增加了23.22 mg/gVSS，PN/PS显著降低。当回流比为100%时，系统中污泥EPS分泌明显增加，其中紧密性多糖（TB-PS）含量增加了24.53 mg/gVSS，PN/PS进一步降低，颗粒污泥上浮现象明显减少。图5   不同回流比下污泥EPS组分及含量的变化Fig. 5   Variations in EPS composition and content of granule sludge under different recirculation ratios

5.污泥表面官能团的变化

不同回流比下厌氧氨氧化系统中污泥表面官能团的变化情况如6图所示。由图6可以看出，当回流比为0%时，系统中波数1 634 cm^-1处出现C=C的拉伸振动，波数1 547.3 cm^-1处出现C-C和C-N的拉伸振动，波数1 032.7 cm^-1处出现C-O的拉伸振动，波数825.7 cm^-1处出现-CH的拉伸振动。当回流比为50%和100%时，系统中的特征峰基本一致，且波数变化较小，这说明出水回流并没有改变系统中颗粒污泥表面官能团的种类。但在1 634 cm^-1处和1 032.7 cm^-1附近的特征峰强度明显增大，且回流比为100%时的特征峰强度最大。图6   不同回流比下污泥表面官能团的变化Fig. 6   Variations in surface functional groups of granule sludge under different recirculation ratios

6.微生物特性的变化

（1） Alpha多样性指数的变化不同回流比下厌氧氨氧化系统中Alpha多样性指数的变化情况如表1所示。由表1可以看出，当回流比为0%时，系统中OTUs、Shannon、Chao1、Ace、Simpson和Shannoneven指数分别为852、3.328、866、887、0.163和0.493。当回流比为50%和100%时，系统中的OTUs、Chao1、Ace和Simpson指数都有所减小，且回流比为100%时的Shannon和Shannoneven指数也有所减小，而回流比为50%时的Shannon和Shannoneven指数有所增大，这说明出水回流使厌氧氨氧化系统中细菌群落的丰富度有所降低，且高回流比条件下系统中细菌群落的多样性也有所降低。

表1   不同回流比下Alpha多样性指数的变化Table 1   Variations in alpha diversity indices under different recirculation ratios

 

 

（2）微生物群落结构的变化不同回流比下厌氧氨氧化系统中微生物群落结构的变化情况如图7所示。由图7可以看出，当回流比分别为0%、50%和100%时，系统中优势菌门及相对丰度分别为：Planctomycetota（浮霉菌门，47.91%、47.38%、52.13%）、Pseudomonadota（假单胞菌门，18.69%、21.54%、21.86%）、Acidobacteriota（酸杆菌门，10.19%、8.59%、8.55%）、Chloroflexota（绿弯菌门，5.31%、4.94%、3.73%）、Patescibacteria（髌骨菌门，2.16%、2.38%、1.31%）、NB1-j（5.00%、3.39%、2.78%）。出水回流提高了Planctomycetota和Pseudomonadota的相对丰度，但降低了Acidobacteriota、Chloroflexota、Patescibacteria和NB1-j的相对丰度。图7   不同回流比下微生物群落结构的变化Fig. 7   Variations in microbial community structure under different recirculation ratios

A：门水平的相对丰度；B：属水平的相对丰度

A: Relative abundance at the phylum level; B: Relative abundance at the genus level

当回流比为分别为0%、50%和100%时，系统中的优势菌属及相对丰度分别为：Candidatus_Brocadia（38.79%、36.20%、38.61%）、Denitratisoma（6.57%、8.70%、10.68%）、norank_mle1-8（5.84%、7.57%、10.53%）、norank_NB1-j（5.00%、3.39%、2.77%）、norank_SC-I-84（3.17%、3.18%、2.54%）、Limnobacter（1.95%、1.70%、1.67%）。出水回流提高了Denitratisoma和norank_mle1-8的相对丰度，但降低了Candidatus_Brocadia、norank_NB1-j、norank_SC-I-84和Limnobacter的相对丰度，且高回流比对Candidatus_Brocadia的相对丰度影响很小。

（3） 氮代谢相关功能基因的变化不同回流比下厌氧氨氧化系统中氮代谢相关功能基因的变化情况如图8所示，不同回流比条件下，系统中与氮代谢相关的功能基因共有46个。硝化作用中的功能基因包括：pmoA-amoA、pmoB-amoB、pmoC-amoC和hao，其中，hao作为关键调控基因在硝化作用中发挥主导作用。反硝化作用中的功能基因包括：narG、napA、nirS、nirK、norB、norC和nosZ，其中，narG是该作用中的核心功能基因。厌氧氨氧化作用中的功能基因包括nirK、nirS、nirA、nirB、narG、narZ、narK、narB和hao。此外，研究还发现同化硝酸盐还原作用特异关联基因nasA，而异化硝酸盐还原作用则主要由nirB介导。当回流比为50%时，系统中的功能基因pmoA-amoA、pmoB-amoB、pmoC-amoC、nirS、narG、narZ和napA出现上调，而hao、nirA和narB出现下调。当回流比为100%时，系统中的功能基因narG、napA、nirS和narZ出现上调，而pmoA-amoA、pmoB-amoB、pmoC-amoC、nirK和hao出现下调。图8   氮代谢相关功能基因的变化Fig. 8   Variations in nitrogen metabolism-related functional gene abundance under different recirculation ratios

三、 讨论

1. 回流比对厌氧氨氧化系统脱氮性能的影响

在无回流条件下，脱氮性能相对较低，这是因为系统中泥水混合不够充分，且进水中的溶解氧和高浓度的亚硝态氮不利于厌氧氨氧化菌的增殖。有研究表明，当系统中亚硝态氮浓度为70-170 mg/L时，亚硝态氮会对厌氧氨氧化菌产生一定的抑制作用^［11］。另外由于进水中存在一定的溶解氧，使得系统中的亚硝酸盐氧化细菌将部分亚硝态氮转化为硝态氮，导致化学计量比偏离理论值及出水ORP升高。当回流增加至50%后，系统中的亚硝态氮浓度得到一定的稀释，由于亚硝态氮对厌氧氨氧化菌的抑制作用可逆，从而减少了对厌氧氨氧化菌活性的抑制^［12］。同时可以增加系统中污水的上升流速和水流剪切力，改善泥水混合效果，增加微生物与底物的接触时间和接触面积^［7］。也可以改善系统中的氧环境，这有利于厌氧氨氧化菌和反硝化菌生长繁殖，反硝化菌利用内碳源将硝态氮转化为氮气^［2, 13］。但此时系统脱氮性能不够稳定，且有待进一步提高。当回流比为100%时，系统中的泥水混合效果进一步得到改善，此时系统中污水的上升流速和水流剪切力进一步提高了颗粒污泥内部传质效率，使底物迅速穿过颗粒污泥外层，到达内部厌氧氨氧化菌的作用位点，减少了颗粒污泥内部底物浓度梯度^［14］。高传质效率可以加速底物的消耗，避免其在颗粒污泥表面的过度积累，同时降低了高浓度亚硝态氮对厌氧氨氧化菌的抑制作用，为厌氧氨氧化菌持续提供充足的底物，使其具有更高的活性。此外更好的水力条件可以强化菌体之间的信息交流，促进厌氧氨氧化菌的生长和繁殖，使系统保持高效、稳定的脱氮性能^［15］。高回流会使得系统中生成的氮气量进一步增加，导致气相分压增大，从而降低污水中溶解氧的饱和度。同时生成的氮气气泡在上升过程中会携带溶解氧逸出系统，造成系统溶解氧的降低。而高浓度氨氮和低溶解氧环境更有利于氨氧化细菌生存，因此系统中的氨氧化细菌将部分氨氮转化为亚硝态氮。同时系统中氨氮和亚硝态氮浓度被进一步稀释，厌氧氨氧化菌的底物亲和力优势得到发挥，使得厌氧氨氧化作用占据主导地位^［16］。厌氧氨氧化菌还可以利用自身糖原，通过DNRA途径将部分硝态氮转化为氨氮和亚硝态氮。此外，低溶解氧环境也有利于内源反硝化作用，使出水氧化还原电位低于进水。

2. 回流比对厌氧氨氧化系统污泥特性的影响

回流对厌氧氨氧化系统污泥特性的影响主要体现在表面形态、EPS组成及官能团等多个层面。随着回流比的增加，污泥颜色加深与粒径增大，这是因为出水回流提高了系统中厌氧氨氧化菌的活性和水流剪切力，能促进细胞色素C的合成和胞外聚合物的分泌，有利于絮状污泥聚集形成颗粒污泥^［17］。同时出水回流增加了颗粒污泥表面的孔隙率，使更多的基质进入到颗粒污泥内部，增强了颗粒污泥内部微生物的活性，且有利于颗粒污泥内部产生的气体及时排出，减少了颗粒污泥的上浮^［8］，从而提升系统的运行稳定性。在EPS组成方面，回流比的提高改变了微生物的代谢响应。在50%回流条件下，系统中的水流剪切力增加，改善了系统中的氧环境，使得紧密型蛋白质被剥离，部分微生物进入内源呼吸，通过分解自身蛋白质来维持正常代谢^［18］。同时水流剪切力的增加促使微生物分泌更多的亲水性多糖以形成保护性基质，从而增强颗粒污泥的抗冲击能力，避免解体。多糖含量的增加有助于微生物吸附底物，提高厌氧氨氧化菌的活性和稳定性，但过量的松散型多糖使污泥沉降性能下降^［19］，从而影响系统的脱氮性能，这也是第Ⅱ阶段系统脱氮性能不够稳定的原因之一。当回流比进一步提高至100%时，微生物为了应对更强的水力剪切，微生物可能优先在颗粒污泥内部分泌更多的多糖，通过增加共价键（如糖苷键）或离子交联（如Ca??桥接）形成稳定的链间交联和桥接，以增强颗粒污泥的机械强度^［19］，这是厌氧氨氧化菌高效脱氮的前提保障。同时为了防止过量的松散型多糖导致污泥沉降性能下降，微生物会分泌大量的紧密型多糖来改善颗粒污泥的紧密度，以保持其良好的沉降性能^［20］。紧密型多糖网络虽然致密，但是在高回流长期作用下，颗粒污泥表面可能会形成纳米级孔径或者亲水通道，允许小分子底物（NH₄⁺-N、NO₂^--N）扩散至厌氧氨氧化菌内部，同时阻碍溶解氧等有害物质进入内核，实现选择性传质，从而维持厌氧氨氧化系统高效、稳定运行。官能团分析结果进一步从分子层面揭示了回流比的影响。尽管不同回流比下官能团种类未发生改变，但在1 634 cm^-1处和1 032.7 cm^-1附近的特征峰强度的增强，表明出水回流能促进颗粒污泥产生酰胺类物质中的血红素蛋白（细胞色素C），加快细胞色素C介导的电子转移^［21］，同时出水回流改变了系统内部环境，诱导污泥分泌更多的多糖，多糖可以通过物理包裹和化学吸附作用稳定颗粒污泥结构，两者共同作用使系统脱氮性能进一步提高。

3. 回流比对厌氧氨氧化系统微生物特性的影响

随着回流比的提高，厌氧氨氧化系统中微生物群落的Alpha多样性呈现下降趋势，表明回流对微生物群落具有筛选作用，促使菌群结构向功能特化方向发展。这一变化在门水平和属水平的群落结构演变中得到了进一步体现，在门水平上，Planctomycetota中存在大量的厌氧氨氧化菌，它是厌氧氨氧化系统中的主要菌门^［22］，而大多数硝化细菌和反硝化细菌都存在于Pseudomonadota中^［23］，Acidobacteriota是嗜酸菌，主要用于降解复杂的有机物，Chloroflexota作为兼性厌氧菌，参与有机酸代谢并辅助电子传递链，通过耗氧代谢维持厌氧氨氧化菌所需的严格厌氧环境^［24］，NB1-j可以参与氮代谢，会影响与氮循环基因对应的预测基因的数量^［25］。Planctomycetota和Pseudomonadota的相对丰度随回流比增加而上升是因为无回流时，系统中微生物传质效率低、基质扩散不均匀和局部亚硝酸盐浓度过高，亚硝酸盐浓度过高会对变形菌产生毒害作用，导致Pseudomonadota含量减少，而Chloroflexota可以利用死亡的细菌作为碳源进行代谢。出水回流改善了系统中的氧环境，同时稀释了系统中的亚硝态氮浓度，有利于Planctomycetota和Pseudomonadota的生长和繁殖，这与傅慧敏等^［7］的研究结果一致。值得注意的是，出水回流会破坏Chloroflexota菌丝状结构，导致其相对丰度下降，但提高了污泥颗粒化程度。同时系统中厌氧氨氧化和反硝化作用增强，而硝化作用受到抑制，导致系统中的产酸量减少，进而引起Acidobacteriota的相对丰度的降低。在属水平上，Candidatus_Brocadia属于厌氧氨氧化功能菌属，在高浓度底物环境下更易生存，尽管面对回流对底物的稀释效应，在100%回流条件下仍保持较高丰度（38.61%），表明其具有较强的环境适应性。更为重要的是，Denitratisoma和norank_mle1-8等反硝化菌属的丰度随回流比增加而显著上升，这与回流创造的低氧环境密切相关，系统中氧环境的改善有利于Denitratisoma和norank_mle1-8的增殖。有研究表明，Denitratisoma可以辅助厌氧氨氧化菌脱氮和改善系统内部环境，而Candidatus_Brocadia合成的信号分子又可以驱动Denitratisoma去除系统中残留的亚硝态氮和硝态氮，从而提高系统脱氮效率^［26］。norank_SC-I-84可以利用三羧酸循环（TCA）产生的NADH作为反硝化的电子供体，进一步促进Denitratisoma的生长。另外norank_SC-I-84合成的氨基酸和维生素可以与厌氧氨氧化菌的代谢产物进行交换，为其提供有利的生存环境^［27］。Limnobacter作为厌氧氨氧化菌的伴生菌属，能抵御外部环境的不利影响^［28］。从功能基因表达层面来看，回流比的调控作用尤为明显。在50%回流条件下，进水中的溶解氧激活了氨氧化菌的代谢活性，促进了pmoA-amoA、pmoB-amoB和pmoC-amoC的表达，加快了NH₄⁺向NH₂OH的转化。nirS、narG、narZ和napA的上调说明系统中的硝酸盐含量由于硝化作用得到增加，这可能会驱动反硝化菌通过硝酸盐还原途径（narG和napA）生成亚硝酸盐，以供nirS进一步还原为NO。此外，hao、nirA和narB的下调可能是因为此时NH₂OH氧化途径中的hao活性受限，且厌氧氨氧化菌对亚硝酸盐去除量的减少，影响了nirA和narB的表达。当回流比进一步增加到100%后，改善了系统中的氧环境，抑制了硝化细菌的硝化作用，导致pmoA-amoA、pmoB-amoB和pmoC-amoC的下调，同时增强了反硝化细菌的反硝化作用，促进了narG、napA、nirS和narZ的表达。Zhen等^［29］发现Denitratisoma基因组携带完整的narG、nirS基因簇，且其在反硝化隔室中的相对丰度与亚硝酸盐的积累量显著正相关。Lin等^［30］也发现Denitratisoma的富集与narG表达强度呈正相关，narG表达强度下降会直接导致反硝化效率下降，在此过程中生成的NO?^-和NO进一步被氨氧化菌用于脱氮。在厌氧氨氧化代谢过程中，nirS和narZ的上调促进了亚硝酸盐还原、硝酸盐异化还原和细胞色素C的合成^［31］，这不仅优化了电子传递链效率，增强细胞内能量（ATP）的合成能力，还能维持细胞内氧化还原平衡，增强菌群对环境波动的耐受性，使系统保持高效、稳定的脱氮性能。

4 .出水回流对厌氧氨氧化系统的作用机制

由图9可以看出，出水回流对厌氧氨氧化系统的作用机制涉及物理—化学—生物多个层面：

（1）物理层面：降低高浓度亚硝态氮对厌氧氨氧化菌的抑制作用，增加系统中污水的上升流速和水流剪切力，改善泥水混合效果，提高底物传质效率。提高污泥颗粒化程度，增加颗粒污泥表面的孔隙率，使颗粒污泥内部产生的气体及时排出，减少颗粒污泥的上浮；

（2）化学层面：促进污泥EPS中多糖的分泌，形成更稳定的抗剪切结构，促进厌氧氨氧化菌对底物的摄取，阻碍溶解氧等有害物质进入内核。增加颗粒污泥表面的C-O和C=C官能团，促进酰胺类物质中血红素蛋白（细胞色素C）的合成，加快细胞色素C介导的电子转移；（3）生物层面：降低系统中的氧化还原电位，改善系统中的氧环境。降低系统中细菌群落的丰富度和多样性，促进厌氧氨氧化菌属Candidatus_ Brocadia与反硝化菌属Denitratisoma协同脱氮。上调氮代谢相关功能基因narG、napA、narZ和nirS，下调pmoA-amoA、pmoB-amoB 、pmoC-amoC、nirK和hao。利用信号分子AHLs介导系统中微生物的群体感应，激活转录调控因子，增加关键酶Nar和Nir的活性。通过TCA循环与ATP合成通路增效，提升系统氮代谢过程中的能量利用效率。最终，在它们的共同作用下，提高了厌氧氨氧化系统的脱氮性能和稳定性。图9   出水回流对厌氧氨氧化系统的作用机制Fig. 9   Underlying mechanism of effluent recirculation in anammox systems

四、 结论

（1）当回流比为100%时，系统平均总氮去除率和平均NRR分别为71.93%和316.59 mg/（L.d），系统脱氮性能更高且更稳定。

（2）颗粒污泥颜色更红，上浮现象明显减少，紧密结合型多糖和松散结合型多糖含量分别增加了22.59和24.00 mg/gVSS，表面的C-O和C=C官能团增加。

（3）Candidatus_Brocadia维持较高的相对丰度（38.61%），Denitratisoma的相对丰度增加了4.13%，同时氮代谢相关功能基因narG、napA、narZ和nirS出现了上调。出水回流改善了厌氧氨氧化系统中的菌群结构，促进了厌氧氨氧化菌与反硝化菌协同脱氮。