大蒜素促进污泥发酵的机制：关注发酵过程和微生物代谢特性

摘要：作为一种具有抗菌活性的常用产品，食用的大蒜素可以在活性污泥（WAS）中分离和浓缩。本研究旨在揭示大蒜素对WAS发酵过程中挥发性脂肪酸（VFA）生成的影响。结果表明，大蒜素（10 mg/g TSS）的适当存在显著提高了VFA产量（1894mgCOD/Lvs对照组的575mgCOD/L），同时增加了乙酸比例（24.3%）。进一步探索发现，大蒜素同时促进WAS的溶解、水解和酸化。宏基因组分析表明，参与细胞外水解代谢、膜转运、底物代谢和脂肪酸合成的关键基因均高度表达。大蒜素还诱导细菌产生更多的信号分子并调节细胞功能，从而增强微生物对不利环境的适应性和调节能力。此外，揭示了发酵微生物的演替及其对VFA产生的功能基因（即ytfR、gltL、INV、iolD和pflD）上调的贡献。总的来说，功能性微生物丰度和代谢活性的同时刺激有助于大蒜素条件反应器中VFA的产生。

引言

大蒜素因其独特的风味而广泛存在于日常食品（如蒜苗和洋葱）中。此外，作为一种天然广谱抗生素，它已广泛应用于医疗实践中，作为疾病的治疗方法。因此，日常生活中大蒜素的大量消耗将导致其大量排放并进入附近的污水处理厂，并可能集中在WAS中。据报道，大蒜素可以干扰细胞膜稳定性，并抑制某些微生物的代谢活性。先前的研究表明，大蒜素可能影响古细菌群落，并降低产甲烷菌的相对丰度。WAS中存在的大蒜素如何影响微生物结构和随后的VFA生产仍然未知。

本研究旨在揭示大蒜素对WAS发酵生产VFA的影响。还公开了大蒜素与WAS增溶、水解和酸化效率的关联。用宏基因综合分析了与发酵物质代谢和VFA生物合成有关的功能遗传基因表达及其与微生物群落演替的相互关系。这项工作扩展了大蒜素对WAS发酵过程的影响的理解，特别是在遗传和功能特性方面，并为外源污染物与发酵效率的相关性提供了新的视角。

 

Fig. 1. – ( A ) VFAs variations, and (B) individual VFAs ratio in different WAS fermentation reactors.

     第4天，对照反应器（R0）中VFA的最大累积量为575 mg COD/L。然而，添加大蒜素后，VFA产量显著提高。然而，大蒜素剂量的进一步增加对VFA的促进作用不大。在R3（50 mg大蒜素/g TSS）和R4（100 mg大蒜素/g TSS）反应器中，最高VFA累积量分别为约2077和2248 mg COD/L。

大蒜素的添加对WAS发酵过程中VFA产物的分布有显著影响（图1B）。例如，丙酸是对照组的主要VFA（41.4%），而乙酸的比例仅占总VFA的5.9%。然而，在R1反应器中乙酸的比例增加到24.3%，在R3反应器中进一步增加到33.4%。因此，提高乙酸的比例将进一步提高WAS发酵产品的经济价值和实用价值。

 

Fig. 2. – ( A ) Concentrations of soluble carbohydrates and proteins; (B) Concentrations of LB-EPS and TB-EPS; (C) EEM fluorescence spectra of SMP during WAS fermentation. 

     如图2A所示，在大蒜素的存在下，可溶性底物的水平都增加了。在R0反应器中，可溶性蛋白质和碳水化合物在第2天分别仅为45.1和43.7 mg/L。在R1反应器中，它们分别提高到173.3和55.2 mg/L，在R4中进一步提高到469.7和76.7 mg/L。通过发酵上清液的EEM表征也证明了大蒜素对WAS增溶的积极作用（图2C）。发酵液中的主要可溶性底物是色氨酸样蛋白（T1和T2位）和酪氨酸样蛋白（B1和B2位），它们通常被公认为可被普通细菌生物降解。然而，添加大蒜素后，荧光强度（与荧光底物浓度呈正相关）增强。在大蒜素条件反应器中，TB-EPS和LB-EPS的含量均降低，且降低趋势与大蒜素剂量密切相关。

因此，可以得出结论，在溶解过程中，添加大蒜素促进了WAS中EPS的破坏，并导致可溶性有机物的明显增加。

 

Fig. 3. – ( A ) The concentrations of soluble hydrosates and the enzymatic activities of hydrolases; (B) the relative activities of acid-forming enzyme during WAS fermentation at day 4. 

     如图3A所示NH₄⁺-N和PO₄^3?的含量，第4天R0反应器中的磷酸根释放量分别为13.2和46.1 mg/L。然而，随着大蒜素剂量的增加，它们逐渐增加。与对照组相比，参与蛋白质和碳水化合物水解过程的蛋白酶和α-葡萄糖苷酶的酶活性在R1反应器中分别增加了1.16倍和1.28倍，在R3反应器中增加了1.31倍和1.46倍。显然，大蒜素的存在也有利于WAS水解步骤，并在加速后续VFA生产中发挥了重要作用。

     如图3B所示，与R0反应器（100%的对照）相比，PTA和ACK的活性在R1反应器中分别提高到105.5%和132.2%，在R3再反应器中进一步提高到114%和132%，这是调节乙酸生成的重要酶。然而，负责丙酸形成的SCOT和OAATC的酶活性在R1反应器中分别为95.5%和91.7%，在R3反应器中进一步降低至86.8%和88.9%。这些结果与添加大蒜素的发酵反应器中的VFA组成变化（乙酸比例增加但丙酸比例降低）一致。

 

Fig. 4. – ( A ) The relative abundances of critical functions based on KEGG classifications, (B) Key genes responsible for membrane transporters, (C) Key genes responsible for carbohydrate metabolism, (D) Key genes responsible for amino metabolism.

     如图4A所示，负责有机物质递送的膜转运代谢的相对丰度在R0中为35.9%，在R1中为37.5%，在R3反应器中为37.6%。特别是，参与ATP结合盒（ABC）转运体的绝大多数基因明显上调（图4（B）和图S2），这些转运体是多种物质（如碳水化合物和蛋白质）进入细胞的主要转运体。与对照组相比，在R1反应器中，ytfQ、ytfT和ytfR的相对丰度分别提高了1.7、2.4和9.69倍，在R3反应器中分别提高到2.3、11.5和16.0倍。

     此外，进一步分析了葡萄糖代谢途径中注释的同源基因表达。负责水解O-和S-糖基化合物的INV（[EC:3.2.1.26]）的相对丰度在R1和R3中分别比对照组高6.0-和76.8倍。此外，与对照组相比，参与葡萄糖水解的编码α-葡萄糖苷酶的malZ（[EC:3.2.1.20]）和编码4-α-葡聚糖转移酶的malQ（[EC:2.4.1.25]）的分布在大蒜素条件下的反应器中表现出相当的上升趋势，R1分别提高了1.5倍和1.2倍。

类似地，参与氨基酸代谢的功能基因在大蒜素条件反应器中也显著增强。

通过作用于肽键（肽酶）与氨基酸水解相关的vanXY（[EC:3.4.13.22]）的基因命中明显上调。此外，在R1和R3中，编码3D-（3,5/4）-三羟基环己烷-1,2-二酮酰水解酶（去环化）的iolD（[EC:3.7.1.22]）的相对丰度分别增加了1.3倍和2.6倍。在R1和R3中，参与天冬氨酸代谢的吡咯BI（天冬氨酰氨基转移酶，[EC:2.1.2]）和yhdR（天冬酰胺氨基转移酶（[EC:2.6.1.1]）的相对丰度分别提高了3.1倍和14.6倍，3.5倍和6.0倍。很明显，负责碳水和蛋白质化合物的功能基因的显著上调将有助于其生物转化为最终的VFA产物。

 

Fig. 6. – ( A ) The level of LDH release and ATP (B) Key genes responsible for quorum sensing in different reactor. 

     据报道，大蒜素会迅速扩散穿过细胞膜，从而破坏细胞内的化学物质并降低酶活性。在这项研究中，LDH释放（经常用作研究细胞结构完整性的指标）实际上观察到随着大蒜素的添加而增加。如图6A所示，与对照组相比，R1和R3反应器中LDH释放分别增加到154%和1245%，表明大蒜素对细菌细胞的破坏作用。

     然而，微生物通常具有一定的适应和恢复能力，以应对不利条件。其中，参与种间通信的自体诱导蛋白-2（AI-2）对增强群体感应至关重要，其产生受luxS调控。在R0、R1和R3反应器中，luxS的相对丰度分别为0.013%、0.046%和0.048%。同时，微生物可以通过lsr运输系统使AI-2相互作用，从而调节邻近物种的行为。在大蒜素条件反应器中，这些基因的相对丰度也显著提高。因此，预计大蒜素的存在可以诱导细菌产生更多的信号分子并调节细胞功能，从而增强微生物对不利环境的适应能力和调节机制。

 

Fig. 7. – T h e microbial population in different reactors at (A) phylum level and (B) genus level, and (C) the relative microbial contributions.

     微生物是VFA生产的生物化学过程中的关键参与者。它们的分布和丰度与厌氧发酵过程中VFA的产生高度相关。因此，还研究了不同大蒜素水平的反应器中的微生物多样性。如图7A所示，对照和大蒜素条件反应器中的微生物种群在门水平上相似。主要细菌为变形杆菌（48.4%）?49.9%）和拟杆菌（12.7%）?16.1%），这是传统厌氧消化器中存在的典型微生物，其中一些可能参与有机物分解和VFA形成。

     然而，在属水平上，微生物种群发生了显著变化，在大蒜素条件下的反应器中观察到一些微生物显著增强，这可能是由群体感应引起的（图7B）。例如，在R0、R1和R3反应器中，能够有效分解有机物质并将其转化为VFA的β-杆菌_norank的相对丰度分别为2.74%、3.08%和3.52%（Wu等人，2020a）。这些结果与大蒜素对碳水化合物和氨基酸代谢的积极作用一致。

     还分析了主要发酵细菌与功能基因表达的相互关系（图7C）。对于溶解过程，拟杆菌_norank对所有反应器中的关键基因表达（如GH3和CE14）贡献最大。然而，与膜转运相关的基因表达的微生物分布表现出显著差异。

     在发酵过程中，大蒜素调理显著影响了微生物结构，这可能导致导致不同代谢酶分泌的不同遗传表达。这些可能是不同反应器中不同VFA浓度和分布模式的主要原因。

 

Fig. 8. – P r o p o s e d mechanisms for the VFAs enhancement during WAS fermentation driven by allicin. 

     参与WAS溶解/水解的关键酶（即蛋白酶和α-葡萄糖苷酶）和编码基因（即CAZy酶）被上调。它有利于分解大分子有机物（即碳水化合物和蛋白质）并转化为可溶性小分子或有机物，为进一步代谢提供了足够的生物利用底物。此外，大蒜素的存在也促进了发酵细菌的跨膜转运，编码基因（即gtsA和ytfT）增加。这将加速细胞外基质向细胞内细胞的递送和转移，以进行微生物代谢。更重要的是，与底物分解相关的功能基因（即pfkC、apgM、yhdR、glnA、INV、accA和fas）和VFA生物合成（即accB、accC和accD）在大蒜素条件反应器中也显示出高水平。这些因素会影响相应微生物酶（即PTA和AK）的分泌和功能，并促进VFA的产生。

小结

     大蒜素的存在通过同时增强溶解、水解和酸化步骤，促进了WAS发酵过程中VFA的生成。进一步分析表明，大蒜素可能在不利环境中刺激微生物的适应能力和调节机制，从而有助于功能性发酵细菌的富集。负责细胞外水解代谢、膜转运、细胞内底物代谢和脂肪酸生物合成的重要基因都在大蒜素条件反应器中高度表达。这些因素有助于提高发酵系统中的微生物代谢活性，并最终有利于本研究中观察到的VFA生产。