PCR实验室建筑及暖通空调设计要点

PCR实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。其特点是能将微量的DNA大幅增加，是分子生物学研究和实验的常规方法，PCR实验室广泛应用于生物学各个领域。

目前PCR应用已得到长足的发展，已成为疫病诊断，疫情控制等方面的有力工具，为了避免在PCR方法中出现污染及出现假阳性和假阴性结果等现象，保证结果的准确性，在实验室环境安全控制上严格做到实验室独立区域设计，功能分区明确，保证实验室洁净环境，人流物流严格分流，设计合理的压力梯度，形成有序的气流组织方向，切实做到避免交叉污染。

纵观人类发展历史，平均每1~2年发生一次传染病重大疫情，如2003年的重症急性呼吸综合征（SARS冠状病毒），2005年的禽流感病毒（HSN1禽流感病毒）,2008年的手足口（肠道病毒），2011年的发热伴血小板综合征（新布尼亚病毒），2013年的流感病毒（H7N9病毒），2014年的禽流感（H10N8病毒）和埃博拉病毒，2015年禽流感病毒（H5N6病毒），2016年的塞卡病毒，以及目前的新型冠状病毒肺炎（COVID-19病毒）。疫情爆发突出表现为发病急、进展快、传染性强，因而传染病病原体的快速、准确鉴定，成控制疫情关键因素。此类疾病的诊断大部分是通过核酸扩增的方式来实现检测的，而该过程均需要在高标准的PCR实验室中由专业人士操作完成，因而PCR实验室在传染病重大疫情防控中的疾病诊断和服务成为不可或缺的力量。除了病毒类传染病，PCR实验室可开展的病原微生物检测包括细菌类、真菌类以及原生动物等疾病的诊断，如临床常见的巨细胞病毒、EB病毒、结核分枝杆菌、甲乙型流感病毒肺炎、支原体及衣原体感染、乙肝、丙肝、戊肝等，PCR实验室在疾病诊断和控制中起到极为重要的作用。

基因扩增实验室原则上分为四个单独的工作区域： 试剂储存和准备区 、 标本制备区 、 扩增反应混合物配制和扩增区 、 扩增产物分析区 。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严重遵循单一方向进行，即只能从试剂储存和准备区→→ 标本制备区 →→ 扩增反应混合物配制和扩增区 →→ 扩增产物分析区 。

各实验区之间的试剂和样品传递应通过传递窗进行。

PCR实验室平面布置布局示意图见下图所示：

PCR实验室为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，适宜采用全新风全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送，排风的比例以保证各实验区的压力要求。

3.1 试剂存储和准备区

     该实验区主要进行的操作为存储试剂的准备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域、试剂原材料必须存储在本区内，并在本区内制备成所需的存储试剂。

      对于气流压力的控制，本区没有严格的要求。

3.2 试标本制备区

   该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸（RNA，DNA）提取、储存及其家去至扩增反应管和测定RNA和c DNA的合成。

      本区压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染、另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区不必要的走动。

3.3、扩增反应混合物配制和扩增区

     该区域主要进行的操作为DNA或c DNA扩增、此外，已制备的DNA模板和合成的c DNA（来自样本制备区）的加入和主反应混合液（来自试剂储存和制备区）制备反应混合液等也可以在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

      本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作入加样等应在超净台内进行。

3.4、扩增产物分析区

     该区域主要进行的操作为扩增片段的测定、如使用全自动封闭分析仪器，检测，次区域可不设。

      本 区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区域的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实在工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染，天然基因组DNA的污染，试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先是预防，而不是排除。

4 .1 工作区域的严格划分

（1)各个实验区域设置合理；

（2)各个实验区域要有明显的标记（如醒目的门牌或不同的地面 颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

4 .2 合理的系统设置

（1)合理的空调通风系统设置，尽量采用全新风全送全排的空调系统；

（2)严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。

4.3 规范的操作

（1)临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经

培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作；

（2)在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，

操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施； （3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。

4.4严格的管理

（1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门；

（2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域；

（3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。（4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等

（5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。

4.5完备的实验室配套设施

完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容不同配备相应的设备和仪器，如超净工作台、离心机、加样器等。

5.1、 国家关于 PCR 实验室建设及管理的现行技术规范和标准

《实验室生物安全通用要求》国家标准GB19489-2008

《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8号文

《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文

《临床基因扩增检验实验室设计标准》卫医发[2002]10号文附件

《基因检验实验室技术要求》国家质监检验总局SN/T1193-2003

《洁净室及相关受控环境-生物污染控制》国际标准ISO14698

《洁净厂房设计规范》国家标准GB500732013

《洁净室施工及验收规范》GB50591-2010

《室内空气质量标准》国家标准GB/T18832002

《生物安全实验室建筑技术规范》国家标准GB50346-2011

《病原微生物实验室生物安全管理条例》卫生部(2004-11-12)

《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》

“对于涉及临床样本的操作，应符合 生物安全二级 实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。”

《临床基因扩增（ PCR ）检验实验室规范》

      标本制备区：“可通过在本区内 设立 正压 条件 避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 ”

      扩增区：“ 可 降低本区的气压 以避免气溶胶从本区漏出。 ”

      扩增产物分析区：“采用 负压 条件或减压情况 下 ( 如安装排风扇 ) 可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。 ”

5.2、 PCR   实验室室内设计参数

5.3、空调负荷组成  

①  设备负荷（冰箱、仪器设备）  

②  新风负荷（最大组成部分）

③  围护结构负荷  

④  人员负荷（一般少于常规）  

⑤  照明负荷  

5.4 、空调设计  

①  换气次数≥12次/ 小时  

②  送风采用新风机组经热、湿处理及三级（初效 + 中效 + 亚高效）过滤后送入室内  

③  排风口设置于房间的下部，且在排风口设置高效过滤器  

④  新风机组和排风机均采用变频机组，以应对工况的改变  

⑤  生物安全柜，柜口面风速≥0.5m/s ；采用 Ⅱ 级 B2 型生物安全柜  

⑥  生物安全柜排风系统单独设置，高空排放，且在排风入口设置高效过滤器，室外排风口高于所在建筑物屋面 2m 以上  

⑦  多台生物安全柜并联运行时应采用变风量排风系统，其新风补风系统也应变风量运行  

新、排风系统变风量运行示意图  

5.5 、气流组织设计  

①  为避免交叉污染， PCR实验室空气流向必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→→标本制备区→→扩增反应混合物配制和扩增区→→扩增产物分析区  。

②  气流组织采用上送下排，送风口和排风口布置应使室内气流停滞的空间降低到最小程度  

③  在生物安全柜操作面或其他有气溶胶操作地点的上方附近不得设送风口。  

④  高效过滤器排风口应设在室内被污染风险最高的区域，单向布置，不得有障碍  。

5.6、压差控制

①  缝隙法计算

②  压差控制器控制

③  安装压差控制器  

④  测量实验室、缓冲间与参照区域间的实际压差，和设定值进行比较，根据控制器的 PID 运算得出偏差值，以此为信号控制送风阀的动作，进而对房间送风量及送 / 排风量差进行调节，从而最终控制房间的压差值。  

⑤  条件：闭环控制：变风量调节阀响应时间小于 1S ，风量平衡相应时间小于 3S 。